劉大全,李東華,劉洪斌,宗春輝,高巧營

（天津市南開醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所,天津 300100）

膿毒癥（Sepsis）是創(chuàng)傷、燒傷、休克、感染、大手術(shù)后等臨床急危重病患者的常見嚴重并發(fā)癥之一,是感染引起的一種嚴重的全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）[1-4]。另一方面,微生態(tài)學(xué)（microecology）是研究正常微生物群與宿主相互關(guān)系的生命科學(xué)分支,是微觀層次的生態(tài)學(xué),即細胞或分子水平的生態(tài)學(xué)。而腸道微生態(tài)學(xué)研究的主要內(nèi)容是腸道正常微生物群與宿主和環(huán)境構(gòu)成的相互作用、相互制約的微生態(tài)系客觀規(guī)律。近幾年的研究成果證明,離開腸道微生態(tài)學(xué),對消化道生理、病理學(xué)的研究其結(jié)論必定是不完整的,也是不科學(xué)的不準確的[5]。當機體發(fā)生腸穿孔、腹膜炎進而引起膿毒癥時,其胃腸道內(nèi)的正常菌群必定發(fā)生相應(yīng)的變化,致病菌本身或其代謝產(chǎn)物會參與全身的炎癥反應(yīng),繼而引起多器官功能障礙綜合癥（MODS）等嚴重后果。本研究運用熒光定量PCR和細菌培養(yǎng)的方法觀察病理狀態(tài)下動物模型腸道及腹水內(nèi)的菌群變化情況,試圖從微生態(tài)的角度進一步闡述膿毒癥的發(fā)病機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康Wistar大鼠60只,雌雄各半,體重210-230 g,由中國藥品生物制品檢定所動物中心提供,動物合格證號SCXK（京）2005-0004。

1.2 主要試劑與儀器 糞便DNA提取試劑盒（QIAGEN美國）,普通PCR用Taq酶、熒光定量PCR試劑盒（均為北京天根生化科技有限公司）,細菌培養(yǎng)皿、細菌生化鑒定試劑盒（均為天津金章科技發(fā)展有限公司）,厭氧培養(yǎng)袋（梅里埃公司法國）;IQ5型熒光定量PCR儀（BIO-RAD美國）。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組 前期研究表明:盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)后72 h動物模型的死亡率在50%-70%之間[6],故將Wistar大鼠60只,隨機分為假手術(shù)組（20只）、模型組（40只）。

1.3.2 模型制作 參照Wichterman等[7]的盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）方法,實驗前12 h禁食、不限水,以10%水合氯醛按1 mL/kg劑量進行腹腔注射麻醉,無菌條件下開腹,分離盲腸,在距其末端2 cm處以1號絲線結(jié)扎,再用18號針頭在盲腸末端穿孔2處,將盲腸放回腹腔后逐層關(guān)腹。假手術(shù)組于分離盲腸末端時,不進行結(jié)扎、穿孔。

1.3.3 標本取材與處理 造模72 h后,各組動物在無菌條件下開腹,取腹水進行細菌培養(yǎng)（如動物腹腔內(nèi)無腹水,則注入2ml無菌生理鹽水進行腹腔灌洗,然后取灌洗液進行細菌培養(yǎng)）,同時留取結(jié)腸內(nèi)容物,使用DNA提取試劑盒提取基因組DNA。

1.3.4 腹水細菌培養(yǎng) 取500μl腹水（或灌洗液）作為原液,用無菌生理鹽水進行10倍的倍比稀釋,將不同濃度的菌液分別接種于需氧培養(yǎng)皿（包括血瓊脂培養(yǎng)皿、苯乙醇培養(yǎng)皿、麥康凱培養(yǎng)皿等）和厭氧培養(yǎng)皿上（厭氧培養(yǎng)皿放置于厭氧培養(yǎng)袋中）,分別在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h和72 h。培養(yǎng)結(jié)束后選擇適當?shù)南♂尪壬仙L的菌落進行鏡檢、耐氧試驗和微量生化反應(yīng)試驗,以鑒定細菌的類型。

1.3.5 常規(guī)PCR反應(yīng) 參照文獻[8]并結(jié)合使用引物設(shè)計軟件,針對雙歧桿菌、乳桿菌、大腸埃希菌、脆弱類桿菌和糞腸球菌的16SrRNA序列設(shè)計特異性引物（見表1）。PCR反應(yīng)體系為25μl,其中DNA模板2μl,上下游引物（濃度為 25 pmol/μl）各 1 μl,10×Buffer2.5μl,dNTP 2μl,Taq 酶0.5μl,水16 μl。反應(yīng)程序為:94℃變性4min后,94℃30 s,50℃（或55℃）30 s,72℃30 s共32個循環(huán),最后以72℃10 min延伸后結(jié)束。經(jīng)試驗摸索,大腸埃希菌、雙歧桿菌和脆弱類桿菌PCR反應(yīng)的理想退火溫度為55℃,乳桿菌和糞腸球菌PCR反應(yīng)的理想退火溫度為50℃。其擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

表1 5種細菌的引物序列和擴增片段長度

1.3.6 熒光定量PCR反應(yīng)體系為 20μl其中DNA模板0.5μl,上下游引物（濃度為5 pmol/μl）各1μl,2.5×RealMasterMix和20×SYBR Solution的混合液9 μl,水8.5μl。反應(yīng)程序為:94℃變性4 min后,94℃30 s,50℃（或 55℃）30 s,72℃30 s共40個循環(huán),最后以68℃10min延伸后結(jié)束。

1.3.7 標準曲線的制作 參照文獻[8]的方法,取準確定量的細菌菌株作為標準品（為天津市南開醫(yī)院細菌室保存的質(zhì)控菌株）做系列稀釋后,使其細菌濃度為105109拷貝/m L,并使用DNA提取試劑盒提取基因組DNA。以該DNA為模板進行熒光定量PCR。標準曲線以不同拷貝數(shù)的陽性模板的對數(shù)為橫坐標,以PCR反應(yīng)過程中出現(xiàn)熒光信號的初始循環(huán)數(shù)（Ct）為縱坐標繪制而成。待測樣品的PCR結(jié)果和標準曲線進行比較,即可獲得各待測樣品中5種細菌的具體數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 腹水細菌培養(yǎng) 模型組大鼠40只,造模72 h后仍存活的有23只,大多數(shù)個體有較多的腹腔滲出液,其性狀為淡黃色或淡粉色混濁半透明液體。假手術(shù)組全部存活,大多數(shù)個體無明顯的腹腔滲出液,收集腹腔灌洗液進行檢測。兩組動物腹水或腹腔灌洗液細菌培養(yǎng)結(jié)果見表2。另外,初次厭氧培養(yǎng)出的菌落經(jīng)耐氧試驗篩選后證明全部是需氧菌和兼性厭氧菌,即兩組動物的腹水中沒有專性厭氧菌被檢出。

2.2 PCR產(chǎn)物電泳鑒定 PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳顯示5種細菌的16SrRNA擴增片段,見圖1。

表2 兩組動物腹水中細菌檢出率比較（百分率%）

圖1 細菌16SrRNA擴增片段電泳結(jié)果

2.3 熒光定量PCR標準曲線生成 以標準菌不同拷貝數(shù)的陽性模板的對數(shù)為橫坐標,以PCR反應(yīng)過程中出現(xiàn)熒光信號的初始循環(huán)數(shù)（Ct）為縱坐標繪制生成該菌的標準曲線,圖2為大腸埃希菌的標準曲線。

2.4 腸道菌群定量 通過熒光定量PCR反應(yīng),將待測樣品的檢測結(jié)果和標準曲線進行比較,獲得各樣品中5種細菌的具體數(shù)量。與假手術(shù)組相比,模型組腸道中雙歧桿菌和乳桿菌的數(shù)量明顯減少（P＜0.01）,而大腸埃希菌的數(shù)量則有所增加（P＜0.01）,脆弱類桿菌和糞腸球菌的數(shù)量無明顯變化（P＞0.05）。圖3為大腸埃希菌熒光定量PCR反應(yīng)曲線;兩組動物腸道菌群比較見表3。

圖2 大腸埃希菌的標準曲線

圖3 大腸埃希菌的熒光定量PCR反應(yīng)曲線

3 討論

人類胃腸道表面所攜帶正常菌群的重量差不多有1千克,相當于最大消化腺-肝臟的重量,它們既參與機體代謝的全過程,又參與許多腸道毒物的分解、消化過程,與宿主健康狀態(tài)休戚相關(guān)。人的一生一般要經(jīng)歷兩次正常微生物群的演替過程,第一次是從出生到第1-2周左右,腸道從無菌到有菌,形成具有嬰幼兒特點的腸道菌群;第二次演替是從乳喂養(yǎng)到混合喂養(yǎng),腸道菌群會發(fā)生大的變動。成人腸道菌群是相對穩(wěn)定的,一般因為患病或是用藥才會發(fā)生變動[9]。人類胃腸道約有300 m2的粘膜表面,種植著上萬種不同種群約1013-1014個細菌。在胃腸道不同部位,細菌的定植情況也不相同。胃內(nèi)的正常寄生微生物包括鏈球菌、葡萄球菌、乳桿菌等,由于胃酸的抗微生物作用使得正常的胃內(nèi)的大部分細菌被殺死,除了幽門螺旋桿菌外,其他的胃細菌僅僅在胃酸減少的患者中明顯可見。從小腸分離出的微生物種群有乳桿菌、鏈球菌、雙歧桿菌、梭狀芽孢桿菌、類桿菌、韋榮氏球菌、葡萄球菌、放線菌屬、酵母菌、白色念珠菌、嗜血菌等。耐酸厭氧型革蘭陽性菌種控制著小腸上端部位,而越靠近遠端,革蘭陰性菌逐漸增加而占統(tǒng)治地位。大腸中隱匿有超過500種細菌種群,其中90%以上是專性厭氧菌,主要包括乳桿菌、鏈球菌、雙歧桿菌、梭狀芽孢桿菌、丙酸桿菌、優(yōu)桿菌、類桿菌、梭桿菌屬、韋榮氏球菌、葡萄球菌、酵母菌、放線菌、腸桿菌、腸球菌、糞球菌、消化鏈球菌屬等[10]。

本研究發(fā)現(xiàn),模型組動物進行盲腸結(jié)扎穿孔后,其機體依次發(fā)生了不完全性腸梗阻、腸穿孔和腹膜炎等病理改變,其腸道內(nèi)的正常菌群也發(fā)生了相應(yīng)的變化,在正常狀態(tài)下占優(yōu)勢地位的雙歧桿菌、乳桿菌等益生菌數(shù)量明顯減少,而大腸埃希菌的數(shù)量則有所增加。其中雙歧桿菌和乳桿菌均屬于腸道益生菌,它們參與構(gòu)成腸道的正常防御系統(tǒng)。益生菌在腸道中發(fā)揮重要的生理作用,益生菌通過占據(jù)腸黏膜表面,提高上皮細胞的防御能力,還可以產(chǎn)生有機酸、游離脂肪酸、氨和過氧化氫,具有降低酸度并抑制或拮抗致病菌的作用。如雙歧桿菌及其表面分子能提高NK細胞和巨噬細胞活性,其代謝產(chǎn)物如小分子酸過氧化氫等活性物質(zhì)形成化學(xué)屏障,阻止致病菌侵入和繁殖,進而提高局部或全身的抗感染能力。目前益生菌在治療醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用面不斷擴大,可以應(yīng)用益生菌進行治療的疾病包括:抗生素相關(guān)性腹瀉（AAD）、腸易激綜合癥（IBS）、炎癥性腸?。↖BD）、幽門螺桿菌感染、各種便秘、結(jié)腸癌和高膽固醇血癥等[11]。

另一方面,在本研究中動物腹水細菌培養(yǎng)結(jié)果顯示:模型組大腸埃希菌的檢出率達到100%,說明大腸埃希菌是該模型大鼠主要的致病菌或致死菌。而鏈球菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、摩根氏菌和微球菌等檢出率也高于假手術(shù)組,上述細菌多數(shù)屬于條件致病菌,在正常的腸道中也是存在的,但數(shù)量有限并且與益生菌之間保持平衡狀態(tài),當機體發(fā)生腸梗阻、腸穿孔、腹膜炎和膿毒癥時這種平衡被打破,條件致病菌則會在腸道、腹腔甚至在血液中大量繁殖,進而引起MODS甚至死亡等嚴重后果。

綜上所述,本研究在膿毒癥大鼠模型研究的基礎(chǔ)上,進一步對其腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)進行分析,發(fā)現(xiàn)了膿毒癥大鼠與正常大鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)變化,找出了導(dǎo)致膿毒癥大鼠患病甚至引起死亡的主要致病菌群。從一個新的角度解釋了膿毒癥的病理過程,也同時為達成有效降低膿毒癥死亡率這一全球的共同目標提供理論依據(jù)。

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