胡曉波,郭海艷,胡傳璽,瞿躍紅,李 漫,王 瑛,張建軍

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,上海201900;2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院,上海200011)

鮑曼不動(dòng)桿菌是造成院內(nèi)感染的重要條件致病菌,可引起廣泛的嚴(yán)重感染[1]。近年來隨著抗生素的大量使用,鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥率逐步上升,并已有廣譜耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的出現(xiàn),給臨床治療帶來極大困難[2]。研究顯示,在耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中檢測(cè)到的多數(shù)耐藥基因常位于整合子基因盒中。整合子是細(xì)菌基因組中的可移動(dòng)遺傳物質(zhì),可將許多耐藥基因整合在一起,從而形成多重耐藥[3]。其中 I類整合子在桿菌的耐藥中扮演著重要的角色。I類整合子的結(jié)構(gòu)由5-CS、3-CS及中間的可變序列組成。5-CS攜帶編碼整合酶基因int I和一個(gè)啟動(dòng)子基因片段,3-CS包括3個(gè)開放閱讀框架(ORF):季銨鹽化合物溴乙錠耐藥基因(qacEA1)、磺胺耐藥基因(sul I)和功能尚不清楚的ORF[4-8]。

本實(shí)驗(yàn)收集臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌株,用M IC法檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性,然后采取PCR法檢測(cè)I類整合子的基因。針對(duì)I類整合子保守序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物,將整合子可變區(qū)域的全長(zhǎng)序列擴(kuò)增出來,分析得到插入 I類整合子中對(duì)應(yīng)的耐藥基因。最后統(tǒng)計(jì)分析耐藥組和不耐藥組的差異性。本研究希望能建立一種快速簡(jiǎn)便的I類整合子檢測(cè)方法,監(jiān)測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性及耐藥基因攜帶情況,及時(shí)發(fā)現(xiàn)新的耐藥基因,指導(dǎo)臨床用藥、促進(jìn)感染的恢復(fù)、減少濫用抗生素。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)菌株 收集上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第三人民醫(yī)院2007年9月至2009年9月從痰液、尿液、咽拭和引流液等標(biāo)本分離的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌共63株。標(biāo)準(zhǔn)菌株為大腸埃希菌(ATCC 25922)、銅綠假單胞菌(ATCC 27853)。

1.2 菌株培養(yǎng)和分離 用麥康凱血平板培養(yǎng)分離出Gram陰性桿菌,采用生物梅里埃的Gram陰性菌鑒定板條鑒定鮑曼不動(dòng)桿菌。M IC法檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性,抗生素處理組包括:頭孢噻肟、頭孢西丁、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢呋辛、阿莫西林、哌拉西林、替卡西林、阿莫西林+棒酸、哌拉西林+他唑巴坦、替卡西林+棒酸、美洛培南、亞胺培南、復(fù)方新諾明、妥布霉素、阿米卡星、慶大霉素、奈替米星、環(huán)丙沙星。

1.3 細(xì)菌DNA的提取 從血平板上挑取單個(gè)菌落,加入到50μl雙蒸水中,制成細(xì)菌懸液,100℃水浴10 min。然后以10 000 rpm/min離心5 min,取1 μl上清液作為DNA模板。

1.4 I類整合子 PCR擴(kuò)增 整合子引物序列:Sense 5′-TCTCG GGTAA CATCA AGG-3′,antisense 5′-AAGCA GACTT GACCT GA-3′。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min,然后94℃30 s,60℃30 s,72℃1min,循環(huán)30次,最后72℃延伸10min。

1.5 PCR產(chǎn)物的純化和測(cè)序 PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳,120mV 1 h,溴化乙啶染色,在透射紫外儀下照相觀察。隨后對(duì)凝膠當(dāng)中的PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收并送出測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在GenBank網(wǎng)上比對(duì)查詢。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用Fisher確切概率計(jì)算法對(duì)整合子陽性與整合子陰性鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥率進(jìn)行比較,統(tǒng)計(jì)兩者差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增I類整合子基因

63株鮑曼不動(dòng)桿菌中整合子陽性35株(56%),整合子陰性28株(44%),PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度均約為2 300 bp。圖1當(dāng)中列出了1-16號(hào)鮑曼不動(dòng)桿菌樣本中I類整合子的擴(kuò)增結(jié)果。

圖1 1-16號(hào)鮑曼不動(dòng)桿菌樣本中I類整合子的擴(kuò)增結(jié)果

2.2 藥物敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果 I類整合子陽性菌株對(duì)11種抗生素耐藥率高于 I類整合子陰性菌株,耐藥率見表1。顯示整合子陽性菌株對(duì)頭孢噻肟、頭孢西丁、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢呋辛、阿莫西林、哌拉西林、替卡西林、阿莫西林+棒酸、哌拉西林+他唑巴坦、替卡西林+棒酸、復(fù)方新諾明、妥布霉素、阿米卡星、慶大霉素、奈替米星、環(huán)丙沙星均耐藥。整合子陰性菌株對(duì)頭孢噻肟、頭孢西丁、頭孢他啶、環(huán)丙沙星、阿莫西林、哌拉西林耐藥。整合子陽性和陰性的鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)6種都耐藥的抗生素(頭孢噻肟、頭孢西丁、頭孢他啶、環(huán)丙沙星、阿莫西林、哌拉西林)和2種都敏感的抗生素(亞胺培南、美羅培南)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 產(chǎn)物序列分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收純化后進(jìn)行測(cè)序,實(shí)際長(zhǎng)度為2 347 bp。經(jīng)Pubmed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez)網(wǎng)站BLAST比對(duì)后,在 I類整合子可變區(qū)共有3個(gè)耐藥基因盒:aaeA4、catB8和aadA1,其中aaeA4,aadA1導(dǎo)致鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)氨基糖苷類的耐藥,catB8則導(dǎo)致了其對(duì)氯霉素的耐藥性。

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌是造成院內(nèi)感染的重要條件致病菌,廣泛存在于自然界和人體表面。氨基糖苷類藥物與β內(nèi)酰胺類藥物聯(lián)合用藥曾是治療鮑曼不動(dòng)桿菌感染的有效藥物。但是近年來隨著抗生素的大量使用或?yàn)E用,鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥率逐步上升[1],甚至出現(xiàn)了對(duì)Gram陰性桿菌抗菌譜藥物全部耐藥的菌株,稱為泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌,成為醫(yī)院感染的一種重要的病原菌[2]。近年來臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)頭孢菌素類、氨基糖苷類、喹諾酮類常用抗菌藥物出現(xiàn)多重耐藥性.甚至對(duì)碳青烯霉類藥物也出現(xiàn)耐藥,致嚴(yán)重的院內(nèi)感染,給臨床治療帶來極大困難。

鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥機(jī)制非常復(fù)雜,包括產(chǎn)生多種β內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷類藥物修飾酶、外膜蛋白丟失、青霉素結(jié)合蛋白改變和泵出等[9]。在耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中檢測(cè)到的多數(shù)耐藥基因常位于整合子基因盒中。整合子是細(xì)菌基因組中的可移動(dòng)遺傳物質(zhì),攜帶位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)組分,可將許多耐藥基因整合在一起,從而形成多重耐藥[3]。整合子共分為6類,其中I類整合子分布最為廣泛,在桿菌的耐藥機(jī)制中扮演著非常重要的角色。I類整合子的可變區(qū)域中常常攜帶有重要的抗性基因.包括氨基糖苷類修飾酶基因、金屬酶基因和超廣譜的β內(nèi)酰胺酶基因等,通過對(duì) I類整合子基因盒中攜帶的外源基因的檢測(cè),使我們有可能更深入地了解鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥機(jī)制。

表1 I類整合子陽性與陰性鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥率比較

我們對(duì)I類整合子可變區(qū)的序列進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn),整合子中包括1個(gè)aacA4,catB8和1個(gè)aadA1的基因盒。其中aaeA4,aadA1導(dǎo)致鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)氨基糖苷類的耐藥,catB8編碼對(duì)氯霉素的耐藥性。但同時(shí)我們也看到,I類整合子陰性的鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)許多抗生素也表現(xiàn)出了較強(qiáng)的耐藥性,這些結(jié)果表明,除了I類整合子外,我院鮑曼不動(dòng)桿菌發(fā)生多重耐藥可能還與其它耐藥機(jī)制有關(guān)。研究臨床鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥機(jī)制,加深對(duì)細(xì)菌多重耐藥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移機(jī)制的了解,有助于做好細(xì)菌耐藥性的控制工作。同時(shí)更重要的是加強(qiáng)臨床細(xì)菌耐藥性發(fā)生和發(fā)展的監(jiān)控,合理使用抗菌藥物,延緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。

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