侯曉睿,劉北一*,田建偉,陳益國(guó),富 寧

（1.南方醫(yī)科大學(xué) 免疫學(xué)教研室,廣東 廣州 510515;2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院腎內(nèi)科,廣東 廣州 510515）

晚期氧化蛋白產(chǎn)物（advanced oxidation protein products,AOPP）是體內(nèi)氧化應(yīng)激（oxidative stress）過(guò)程中次氯酸（HOCl）修飾的蛋白產(chǎn)物,在血漿中以HOCl氧化修飾白蛋白為主,目前認(rèn)為AOPP是一類含雙酪氨酸的蛋白質(zhì)交聯(lián)物[1]。循環(huán)AOPP水平增高見(jiàn)于慢性腎臟病及伴透析過(guò)程[1]、糖尿病[2]、動(dòng)脈粥樣硬化[3]、潰瘍性結(jié)腸炎[4]等免疫相關(guān)炎癥性疾病和惡性腫瘤（結(jié)腸、直腸癌、乳腺癌等）[5]等,因此被認(rèn)為是反映體內(nèi)氧化應(yīng)激的敏感指標(biāo)[1]。目前AOPP在體內(nèi)作用機(jī)制尚不十分清楚,且其抗原結(jié)構(gòu)及表位性質(zhì)不明。我們?cè)谇捌谥苽溽槍?duì)AOPP抗體過(guò)程中發(fā)現(xiàn),AOPP免疫原性弱、易于誘導(dǎo)IgM類抗體生成,提示AOPP在結(jié)構(gòu)上存在特殊性。此外,所獲得抗體還可識(shí)別由HOCl修飾、來(lái)自于不同種屬動(dòng)物的白蛋白及人低密度脂蛋白（low density-lipoprotein,LDL）,但與上述蛋白的非氧化及天然形式無(wú)任何交叉反應(yīng),提示在體內(nèi)HOCl氧化修飾蛋白具有共同表位。本文利用抗AOPP多抗篩選噬菌體肽庫(kù),獲得并初步探討所得表位的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),并試圖了解AOPP模擬表位是否存在于正常人與哺乳動(dòng)物的蛋白分子上,是否與AOPP在體內(nèi)的生物學(xué)活性有關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 材料 人血清白蛋白（HSA）購(gòu)自Sigma公司,抗AOPP多克隆抗體[6]由本實(shí)驗(yàn)室制備。噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)（Ph.D.-12TMPhage Display Peptide Library Kit）購(gòu)自New England Biolabs公司。肽庫(kù)滴度為2×1013pfu/ml,受體菌為大腸桿菌E.coli ER2738。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗M 13抗體購(gòu)自GE Healthcare公司。

1.2 方法

1.2.1 AOPP-HSA的制備 依據(jù)Witko-Sarsat等[1]建立的方法制備AOPP-HSA。將HSA與次氯酸以1∶140摩爾比混合,室溫反應(yīng)30min后立即置于PBS中4℃透析24 h,以去除游離的次氯酸。AOPP含量以氯胺-T法標(biāo)定[1],AOPP-HSA中AOPP含量為75.33 nmol/mg蛋白,未經(jīng)修飾HSA中AOPP含量?jī)H為0.16 nmol/mg蛋白。

1.2.2 抗AOPP多克隆抗體對(duì)噬菌體12肽庫(kù)的篩選 經(jīng)親和層析純化的多克隆抗體[6]以100μg/ml包被酶標(biāo)板,5%BSA封閉2 h,0.1%TBS-Tween（TBST）洗板5次,加入 45μl 0.1%TBST和5μl噬菌體12肽庫(kù),室溫孵育1 h;洗板10次后0.2M G ly-HCl洗脫結(jié)合的噬菌體,室溫8min,1M Tris-HCl進(jìn)行中和。以此噬菌體侵染宿主菌ER2738,測(cè)定滴度、擴(kuò)增純化后,用于下一輪篩選。第2、3輪篩選除將洗液改為0.5%TBST以外,其余實(shí)驗(yàn)條件均與第1輪相同。在完成3輪篩選后,測(cè)定噬菌體滴度并隨機(jī)挑取藍(lán)色噬斑制備噬菌體原種用于鑒定。

1.2.3 夾心ELISA鑒定噬菌體克隆與抗AOPP多抗的結(jié)合 抗AOPP多抗（以正常兔IgG為對(duì)照）5 μg/m l,50μl/孔,4℃包被過(guò)夜,0.25%酪蛋白封閉液37℃2 h;依次加入 50μl/孔噬菌體和M13KE載體、HRP-抗M 13單抗（應(yīng)用時(shí) 1∶5 000稀釋）,37℃30 min,TMB顯色,2M硫酸終止。以O(shè)D 450 nm值高于陰性對(duì)照3倍以上的為陽(yáng)性結(jié)果。

1.2.4 DNA序列分析 擴(kuò)增陽(yáng)性噬菌體克隆,按常規(guī)方法純化并提取噬菌體單鏈DNA。樣品送交北京華大有限公司測(cè)序。

1.2.5 競(jìng)爭(zhēng)ELISA鑒定陽(yáng)性噬菌體克隆的特異性2.5μg/ml抗AOPP 多抗50μl/孔,4℃包被過(guò)夜,封閉后同時(shí)加入陽(yáng)性噬菌體克隆上清與不同濃度AOPPHSA或HSA,37℃1 h;洗板后加入HRP-抗M13單抗37℃30min,常規(guī)TMB顯色,并計(jì)算抑制率。

1.2.6 ELISA鑒定陽(yáng)性噬菌體與抗AOPP單抗mAb 3F2、mAb 4C5的結(jié)合 抗 AOPP的單克隆抗體3F2[7]和4C5、多克隆抗體及兔 IgG各5μg/ml,50 μl/孔包被,封閉后加入陽(yáng)性噬菌體克隆No.6、No.1各 50μl/孔,37℃30min,隨后加入 HRP-抗M 13單抗,常規(guī)TMB顯色。

1.2.7 保守序列同源性搜索 采用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）的 BLASTp程序在蛋白質(zhì)水平上對(duì)六條篩選序列分別進(jìn)行同源性搜索,并用哈佛大學(xué)在線抗原性預(yù)測(cè)軟件（http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.html）與DNAstar對(duì)陽(yáng)性序列進(jìn)行了抗原表位預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體十二肽庫(kù)篩選的親和富集 以抗AOPP多克隆抗體（PcAbs）為靶分子,對(duì)噬菌體十二肽庫(kù)進(jìn)行3輪篩選,表1顯示回收率逐輪增加。

表1 PcAb篩選噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)

2.2 噬菌體克隆與PcAbs的結(jié)合 隨機(jī)挑選29個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示其中18個(gè)克隆能與PcAbs特異性結(jié)合,陽(yáng)性率為62.07%（見(jiàn)圖 1）;上述克隆均不與正常兔IgG及僅緩沖液包被孔反應(yīng),排除了非特異結(jié)合與吸板序列存在的可能性。

2.3 陽(yáng)性噬菌體克隆DNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列 選擇18個(gè)陽(yáng)性克隆中的6個(gè)進(jìn)行DNA測(cè)序并推導(dǎo)其氨基酸序列,得到3種序列,其保守序列為L(zhǎng)XDMLXD（見(jiàn)表2）。

表2 陽(yáng)性噬菌體克隆的氨基酸序列

2.4 AOPP-HSA抑制陽(yáng)性噬菌體克隆與多抗結(jié)合

No.1-No.29:phage clones;No.30:unrelated phage;No.31:12mer phage library;No.32:blank control圖1 噬菌體與抗AOPP多克隆抗體的結(jié)合

為進(jìn)一步鑒定噬菌體展示肽序列可模擬AOPP,以AOPP抑制陽(yáng)性噬菌體克隆No.6與抗體的結(jié)合。結(jié)果顯示極低濃度AOPP即可有效抑制No.6（滴度為0.7×1013pfu/m l）與多抗結(jié)合,其IC50為0.2μg/m l（圖2）;而陰性對(duì)照HSA則無(wú)抑制作用。提示該克隆所展示短肽的抗原性與AOPP表位極為相似,即為良好的抗原模擬位短肽。

圖2 AOPP競(jìng)爭(zhēng)抑制陽(yáng)性噬菌體克隆與多抗的結(jié)合

2.5 陽(yáng)性噬菌體克隆可與兩株抗AOPP單抗3F2和4C5結(jié)合 采用夾心ELISA方法檢測(cè)陽(yáng)性克隆（No.1、6）展示序列特異性。結(jié)果顯示具不同序列的陽(yáng)性克隆與抗AOPP單抗3F2和4C5結(jié)合,其中含保守序列的克隆No.6與單抗結(jié)合較No.1克隆明顯,但均不及與多抗的結(jié)合強(qiáng)（見(jiàn)圖3）。該結(jié)果提示兩株單抗與篩選用多抗識(shí)別AOPP聚合分子表面不同的表位。

圖3 陽(yáng)性噬菌體與AOPP單抗3F2、4C5的結(jié)合

2.6 AOPP模擬肽保守序列同源性搜索 經(jīng)從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源搜索,發(fā)現(xiàn)所獲得的三種序列僅存在于某些真菌屬、藻類的蛋白分子上,而并不存在于正常的人類與哺乳動(dòng)物蛋白分子中,從而避免了與AOPP表位相似而導(dǎo)致的后續(xù)事件,也由此支持AOPP并非人體與動(dòng)物的正常蛋白。

3 討論

近年來(lái),AOPP作為氧化應(yīng)激過(guò)程的重要生物標(biāo)志物日益受到重視。我們前期工作證明抗AOPP抗體可識(shí)別HOCl氧化修飾的不同種屬白蛋白,而不與其天然形式反應(yīng),提示AOPP結(jié)構(gòu)中抗原表位為非種屬特異性,因此探討AOPP表位結(jié)構(gòu)特性尤為必要。而揭示AOPP表位結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其可能的分布無(wú)疑有利于深入研究該分子在體內(nèi)的病理生理學(xué)作用。我們所采用的模擬肽策略則是想探索類似AOPP表位是否存在于正常蛋白分子,如果存在是否發(fā)揮相應(yīng)的作用。噬菌體表面展示技術(shù)是一種將外源蛋白與噬菌體衣殼蛋白融合展示在噬菌體表面的生物技術(shù)。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于抗原表位分析、蛋白質(zhì)相互作用等[8]。我們以抗AOPP多克隆抗體來(lái)篩選噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)獲得了18株可與多抗結(jié)合的陽(yáng)性克隆。人工制備AOPP-HSA可顯著抑制No.6陽(yáng)性噬菌體克隆與多抗結(jié)合（IC50=0.2 ug/ml）,提示所篩選的克隆高度模擬AOPP表位的抗原性。氨基酸序列分析得到了相對(duì)保守的序列LXDMLXD,X為任意氨基酸（表2）。由此推斷,如果人或動(dòng)物體內(nèi)正常蛋白表達(dá)此序列,就很可能產(chǎn)生一定程度類似于AOPP的生物學(xué)效應(yīng)。所幸通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)的同源性搜索,發(fā)現(xiàn)該序列僅存在于一些真菌藻類的蛋白分子中,而不存在于正常人與哺乳動(dòng)物的天然蛋白分子,即不會(huì)引起類似于AOPP所誘發(fā)的反應(yīng)。由此也從另一個(gè)角度證明AOPP并非人體或哺乳動(dòng)物的正常蛋白成份。

以往文獻(xiàn)多通過(guò)動(dòng)力學(xué)、質(zhì)譜等方法研究HOCl氧化修飾對(duì)蛋白質(zhì)殘基影響,已明確HOCl在氧化過(guò)程中最先改變氨基酸側(cè)鏈,不同氨基酸與HOCl反應(yīng)速度不同,其氧化修飾后產(chǎn)物也不同,如蛋氨酸的氧化產(chǎn)物為蛋氨酸亞砜。其次HOCl與蛋白質(zhì)酰胺基團(tuán)骨架反應(yīng)是一種慢反應(yīng),可導(dǎo)致蛋白肽鍵斷裂;此外HOCl氧化后促使蛋白聚集、交聯(lián)同時(shí)伴隨二酪氨酸形成[9]。Fu X等通過(guò)構(gòu)建合成肽庫(kù)證明WG基序是氯化主要靶點(diǎn)[10]。Kawakami A.等利用質(zhì)譜證實(shí)在HOCl氧化修飾HSA中主要形成二硫鍵（Cys34）[11]。而我們的工作著重探討AOPP表位免疫原性的結(jié)構(gòu)特殊性。在本研究中所獲得（保守序列LXDMLXD）AOPP模擬表位與上述文獻(xiàn)無(wú)相關(guān)性;利用哈佛大學(xué)在線抗原性預(yù)測(cè)軟件與DNAstar對(duì)陽(yáng)性序列進(jìn)行了抗原表位預(yù)測(cè),提示包含保守殘基的氨基酸序列LFDH/LQDLA可能是高抗原性區(qū)域。綜上本研究中所獲得的陽(yáng)性序列可能為AOPP抗原表位,對(duì)于這種表位的生物學(xué)特性還需經(jīng)合成短肽后進(jìn)一步鑒定。

[1]W itko-SarsatV,FriedlanderM,Capeillere-Blandin C,et al.Advanced oxidation protein productsasanovelmarker of oxidative stress in uremia[J].Kidney Int,1996,49（5）:1304.

[2]Piwowar A,Knapik-KordeckaM,WarwasM.Markers of oxidative protein damage in plasma and urine of type 2 diabetic patients.[J]Br JBiomed Sci.2009;66（4）:194.

[3]Cakatay U,KayaliR,Uzun H.Relation of plasma protein oxidation parametersand paraoxonase activity in the ageing population.Clin Exp Med,2008,8（1）:51.

[4]BaskolM,BaskolG,Kocer D et al.Advanced oxidation protein products:a novelmarker of oxidative stress in ulcerative colitis.[J].JClin Gastroenterol,2008;42（6）:687.

[5]Chandramathi S,Suresh K,Anita ZB et al.Comarative assessment of urinary oxidative indices in breast and colorectal cancer patients[J].JCancer Res Clin Oncol,2009,135（2）:319.

[6]盧 曉,田建偉,劉北一,等.針對(duì)晚期氧化蛋白產(chǎn)物的抗體制備與應(yīng)用[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,2010,26（2）:164.

[7]Liu BY,Hou XR,Zhou QG et al.Detection of advanced oxidation protein products in patientswith chronic kidney diseaseby anovelmonoclonalantibody.Free Radic Res,2011.

[8]Scott JK,Sm ith GP.Searching for peptide ligandswith an epitope library[J].Science,1990,249:386.

[9]Hawkins CL,Pattison DI,DaviesMJ.Hypochlorite-induced oxidation of am ino acids,peptidesand proteins[J].Amino Acids,2003,25:259.

[10]Fu X,Wang Y,Kao J.et al.Specific sequencemotifsdirect theoxygenation and chlorination of tryptophan by myeloperoxidase.[J].Biochemistry,2006,45（12）:3961.

[11]Kawakam iA.,Kubota K.,YamadaN.etal.Identification and characterization ofoxidized human serum albumin.A slight structural change impairs its ligand-binding and antioxidant functions.[J].FEBS J.2006,273:3346.