李 強,許海洋,佟 倩,張顯峰*,于洪泉,姜云鵬,張永海

（1.吉林大學第一醫(yī)院 神經外科,吉林 長春 130021;2.吉林大學第一醫(yī)院心血管內科,吉林 長春 130021;3.吉林大學病理解剖學教研室,吉林 長春 130021）

惡性膠質瘤是一種高侵襲性,低生存率的顱內腫瘤,但對于其診斷治療手段仍然未取得有效進展。由于腫瘤細胞增殖、轉移、血管生成及侵襲性都是脂質介導的信號事件。所以近年來,脂肪生成/脂質代謝在惡性腫瘤研究中已經引起越來越多的學者的關注。磷酸鞘氨醇激酶-1（SphK-1）作為一種脂質酶,而S1P作為其催化底物,與人類多種癌癥存在著必然的聯(lián)系。國外研究表明:SphK-1具有強有力的致瘤性和促血管生成作用,在多種癌細胞中SphK-1 mRNA的表達皆被上調。本文采取免疫組化法檢測SphK-1在正常腦組織和人腦膠質瘤細胞中的陽性表達率,探討其與膠質瘤惡性程度的關系及作為治療靶點的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料 兔抗人Sphk1抗體（濃縮型）,由上海晶天生物有限公司提供;免疫組化試劑盒,由福州邁新有限公司提供;本實驗所使用的10例腦出血患者正常腦組織及人腦膠質瘤石蠟組織標本62例收集于吉林大學第一醫(yī)院神經外科2008年9月-2010年4月外科手術中。其中原發(fā)55例,復發(fā) 7例;男性 35例,女性27例;年齡10-72歲,平均40.50歲。參照2000年WHO神經系統(tǒng)腫瘤分類、分級標準,低級別膠質瘤（Low grade glioma,LGG,Ⅰ、Ⅱ級）28例,其中包括:星形細胞瘤12例,混合少突星形細胞瘤13例,室管膜瘤3例;高級別膠質瘤（High grade glioma,HGG,Ⅲ、Ⅳ級）34例,其中包括:間變性星形細胞瘤11例,間變性少突星形細胞瘤9例,間變性室管膜瘤2例;星形細胞里Ⅳ級4例,少突星形細胞瘤Ⅳ級3例,膠質母細胞瘤5例。術前均未接受放療或化療。

1.2 方法

1.2.1 應用免疫組織化學方法對此10例正常腦組織及62例人腦膠質瘤進行一系列的石蠟包埋及染色,然后應用SphK-1抗體進行染色,在高倍顯微鏡下觀察。

1.2.2 結果分析 免疫組化結果判斷標準如下[1]:SphK-1蛋白染色陽性表現(xiàn)為細胞漿內出現(xiàn)棕褐色顆粒。在400倍視野下,隨機選擇10個視野,計數(shù)100個細胞,分別計算陽性細胞數(shù)及其表達率。根據(jù)陽性細胞率及染色強度按下述標準分級:①陰性（-）,隨機視野中陽性細胞數(shù)小于10%;②弱陽性（+）,胞漿內均勻分布淺棕褐色反應,陽性細胞數(shù)10%-25%;③中等陽性（++）,深棕褐色反應,陽性細胞數(shù)25%-50%;④強陽性（+++）,棕黑色反應,胞漿內呈粗大顆?；驂K狀著色,陽性細胞數(shù)＞50%。

1.2.3 統(tǒng)計分析 根據(jù)數(shù)據(jù)采集的不同方法及統(tǒng)計學處理的不同要求,選用χ2檢驗及spearman相關系數(shù)檢驗,使用統(tǒng)計軟件SPSS 10.0對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。

2 結果

2.1 Sphk-1的染色結果 正常腦組織及21例膠質瘤細胞中未檢測到Sphk-1的表達,41例腫瘤組織中可見細胞質染色陽性,為棕褐色顆粒。見圖1、圖2。

圖1 膠質瘤Ⅰ-Ⅱ級的病理結果（40×10）

圖2 膠質母細胞瘤的病理結果（40×10）

2.2 免疫組化染色結果 本組Sphk-1在膠質瘤中的總陽性表達率為66.1%。膠質瘤與正常腦組織之間,各組間兩兩比較,應用 χ2檢驗,差異均有顯著性（P＜0.01）,通過spearman相關系數(shù)檢驗,r=0.748,P＜0.01,表明SphK-1與人腦膠質瘤的分級存在相關性。Sphk-1蛋白的表達水平與膠質瘤病理級別具有相關性。隨著膠質瘤級別的升高,Sphk-1蛋白表達明顯增高。見表1。

表1 SphK-1在人腦正常腦組織及膠質瘤中的表達

3 討論

膠質細胞瘤為神經上皮性腫瘤,約占顱內腫瘤的45%,根據(jù)腫瘤細胞的分化情況可分為:髓母細胞瘤、星形細胞瘤、少枝膠質細胞瘤、多形性膠質母細胞瘤和室管膜瘤,髓母細胞瘤[2]。惡性膠質細胞瘤進展快,導致其患者的愈后效果較差,相關報道認為:對膠質瘤的治療多年來仍然沒有重大進展,其一年生存率僅為30%,并且其總的生存時間不超過53周。即使應用外科手術、放化療等多種治療手段效果仍不明顯。如此低的生存率很大程度上與膠質瘤的高侵蝕性有密切關系[3]。

眾所周知,腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲與細胞周期失調控、細胞異常增殖相關。最近的研究表明,脂肪生成/脂質代謝在癌癥研究中已經引學者的廣泛關注。首先,脂質是細胞膜的重要組成部分。其次,癌細胞的增長迅速,需要消耗大量的能量。再次,參與惡性腫瘤進展的重要的生物過程（如:細胞增殖、轉移、血管生成等）都是脂質介導的信號事件[4]。而磷酸鞘氨醇激酶-1（SphK）作為一種脂質酶,與其催化底物S1P,與人類多種癌癥有著著必然的聯(lián)系。研究還發(fā)現(xiàn),在人體多種惡性腫瘤中SphK-1mRNA的表達皆被上調[5]。

鞘氨醇激酶-1（sphingosine kinase 1,SphK-1）是一種與細胞生命活動密切相關的鞘氨醇代謝酶[6],在體內發(fā)揮著廣泛的生物學功能。作為體內重要的脂質之一,鞘氨醇（sphingosine）可由SphK-1催化成為促生長因子1-磷酸鞘氨醇（S1P）,也可由神經酰胺合成酶催化生成促凋亡因子-神經酰胺（ceramide）,S1P/ceramide的平衡是決定細胞生存或凋亡的重要因素,而SphK-1是調節(jié)這一平衡的關鍵酶。SphK-1表達增加不僅導致S1P水平升高,改變S1P/ceramide的平衡,從而對抗細胞凋亡,還能增加細胞周期由G1期向S期轉化的速率,進而促進細胞生長。同時S1P還發(fā)揮著第二信使的作用[7]。國外動物實驗研究表明[8]:SphK-1的缺失將使細胞周期停滯,增加促凋亡蛋白Bax在線粒體膜上的積聚,激活細胞凋亡的胞內途徑,從而促使細胞凋亡。

國內外大量研究表明[9]:SphK-1在乳腺癌、結腸癌及胃癌等體內多種惡性腫瘤中表達顯著增加。而對于其在顱內腫瘤中表達的研究卻較少,Nicholas Young[10]等在研究中發(fā)現(xiàn)SphK-1在膠質母細胞瘤中顯著表達,進而刺激其腫瘤細胞的轉移及侵襲。DongHoon Lee等[11]、中山大學的Li Jun等[12]在對大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)SphK-1在星形細胞瘤中表達顯著,并且隨惡性程度的增加而表達增強。但就SphK-1在各型膠質瘤中的表達的研究卻沒有。在本次試驗中我們就SphK-1在多種膠質細胞瘤中的表達進行研究。我們發(fā)現(xiàn)SphK-1蛋白的表達主要位于細胞漿內,其在膠質瘤中的陽性表達率明顯高于正常腦組織,應用spearman相關系數(shù)檢驗,P＜0.01,提示SphK-1表達增強與膠質瘤的發(fā)生發(fā)展有關。SphK-1在低級別膠質瘤與高級別膠質瘤的表達有顯著差異性（P＜0.05）,同時在本次實驗中,我們根據(jù)病理分級把腫瘤標本分為三組,比較各級別膠質瘤中SphK-1的表達后發(fā)現(xiàn)差異存在顯著性（P＜0.05）?？梢奡phK-1的表達隨腫瘤惡性程度的升高而增強,推測SphK-1可能參與了膠質瘤的惡性進展。因此,抑制SphK-1的生成可能減緩腫瘤的侵襲及轉移。

根據(jù)本實驗結果及結合相關文獻報道,我們認為在膠質瘤中SphK-1可促進腫瘤的生長及侵襲,增加腫瘤的惡性程度,進而降低腫瘤的愈后效果,至于其具體機制尚有待進一步研究。同時我們考慮針對SphK-1應用基因技術或抗體免疫反應在不久的將來可能為膠質瘤的治療提供新的策略。

[1]Korshunov A,Golanov A,Tim irgaz V,et al.Immuno-histochemicalmarkers for intracranialependymoma recurrence.An analysis of 88 cases[J].J Neurol Sci,2000,177（1）:72.

[2]王忠誠,神經外科學[M].第1版.武漢:湖北科學技術出版社,2005:541-554.

[3]Jun Li,Hong-Yu Guan,et al.ClinicalSignificance of Sphingosine Kinase-1Expression in Human Astrocytomas Progression and Overall PatientSurvival[J].Clin Cancer Res,2008,14（21）:6996.

[4]Menendez JA,Lupu R,et al.Fatty acid synthase and the lipogenic phenotype in cancerpathogenesis[J].Nat Rev Cancer,2007,7（10）:763.

[5]Van Brocklyn JR,Jackson CA,Pearl DK,et al.Sphingosine kinase-1 expression correlateswith poor survival of patientswith glioblastomamultiforme:rolesof sphingosinekinase isoforms in growth of glioblastoma cell lines[J].JNeuropatholExp Neurol,2005;64（8）:695.

[6]Rosen H,Goetzl EJ.Sphingosine1-phosphate and its receptors:an autocrine and paracrine network[J].Nat Rev Immunol,2005,5（7）:560.

[7]Olivera A,Kohama T,EdsallL,et al.Sphingosine kinase expression increases intracellular sphingosine-1-phosphateand promotes cellgrowth and survival[J].JCell Biol,1999,147（3）:545.

[8]Taha TA,Kitatani K,El-A lwaniM,et al.Loss of sphingosine kiNase-1 activates the intrinsic pathway of programmed cell death:modulation of sphingolipid levels and the induction of apoptosis[J].FASEBJ,2006,20（3）:482.

[10]Lauren Bryan,Barbara S,Paugh,et al.Sphingosine-1-phosphate and interleukin 1 independently regulate PAI-1 and uPAR expression in glioblastoma cells;implications for invasiveness[J].Mol Cancer Res,2008,6（9）:1469.

[11]Dong Hoon Lee,Byeong Tak Jeon,Eun Ae Jeong,et al.A ltered expression of sphingosine kinase 1 and sphingosine-1-phosphate receptor 1 in mousehippocampusafterkainic acid treatment[J].Biochem ical and Biophysical Research Communications,2010,393（3）:476.

[12]Jun Li,Hong-Yu Guan.Li-Yun Gong,et al.ClinicalSignificance ofSphingosine Kinase-1 Expression in Human Astrocytomas Progression and Overall PatientSurvival[J].Clin Cancer Res,2008,14（21）:6996.