楊芙蓮, 聶小偉, 康 銀

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院, 陜西 西安 710021)

0 前 言

紅棗中含有豐富的黃酮類化合物，黃酮類化合物能增強(qiáng)人體內(nèi)Vc的作用，促進(jìn)Vc在人體內(nèi)的積蓄，使人體血脂膽固醇降低，防止血管硬化.黃酮類化合物還可以減小血管通透性，降低其脆性，是預(yù)防和治療高血壓的有效成分[1]，當(dāng)前在醫(yī)藥和保健食品領(lǐng)域有很廣泛的需求和應(yīng)用.

目前黃酮類化合物的提取絕大多數(shù)采用乙醇等有機(jī)溶劑為浸提劑，存在生產(chǎn)成本較高、產(chǎn)品有機(jī)溶劑殘留等問題，以水為浸提劑的方法還很少見報(bào)道.超聲波在植物有效成分的提取方面應(yīng)用較為廣泛[2]，主要是利用其空化效應(yīng)破壞植物細(xì)胞壁，從而有利于有效成分的溶出.由于植物的細(xì)胞壁主要由纖維素、木質(zhì)素和果膠等物質(zhì)構(gòu)成，而紅棗果肉中纖維素和果膠含量較高，所以紅棗中的纖維素和果膠可能是制約紅棗總黃酮最大限度溶出的主要物質(zhì).本研究中果膠復(fù)合酶含有纖維素酶和果膠酶等，能特異性降解纖維素和果膠，破壞細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)總黃酮最大限度地溶出[3].用超聲波同步協(xié)同果膠復(fù)合酶提取陜北灘棗總黃酮的研究實(shí)驗(yàn)尚未見報(bào)道，本文對超聲波協(xié)同果膠復(fù)合酶提取陜北灘棗中總黃酮的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，為陜北灘棗中黃酮類化合物的深度開發(fā)利用提供了理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅棗：陜北清澗黃河灘棗，水分含量27.44%；果膠復(fù)合酶(酶活力：果膠酶≥40萬U/g、纖維素酶≥10萬U/g、木聚糖酶≥20萬U/g、β-葡聚糖酶≥20萬U/g):寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司;蘆丁(生化純);磷酸氫二鉀、檸檬酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、無水乙醇均為分析純.

722型光柵分光光度計(jì):上海光譜儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋:北京長安科學(xué)儀器廠；PHS-3C酸度計(jì):上海雷磁儀器廠；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵:鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱:北京科偉永興儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海亞榮生化儀器廠；BS323S型分析天平:塞多利斯科學(xué)儀器有限公司(北京)；KQ-250TDV高頻數(shù)控超聲波清洗器:昆山市超聲波儀器有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的蘆丁對照品20 mg，加入10 mL甲醇置于水浴鍋微熱使其溶解，冷卻，置于100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，濃度為0.2 mg/mL的蘆丁溶液.精確吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置于10 mL比色管中，加60%乙醇至5 mL，再加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，靜止6 min，然后加入10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，靜止6 min后加1 mol/L氫氧化鈉2 mL，再加蒸餾水至刻度，搖勻，靜止15 min，并以相應(yīng)試劑為空白在500 nm處測定吸光值，然后以蘆丁濃度-吸光度值作圖，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得到蘆丁溶液濃度C和吸光度A關(guān)系的回歸方程及相關(guān)系數(shù)分別為A=10.757C+0.009 9和r=0.997 1.

1.2.2 提取工藝流程

原料→挑選→洗凈→烘烤→破碎→稱量→浸提→抽濾→減壓濃縮→冷卻→顯色→測定總黃酮得率

顱骨缺損一般是由重型顱腦損傷等原因?qū)е嘛B內(nèi)壓增高[1]，為了達(dá)到滿意的效果，進(jìn)行去骨瓣減壓術(shù)導(dǎo)致，當(dāng)然還有一部分患者則是因?yàn)椴p顱骨切除或外傷性顱骨骨折清創(chuàng)而遺留顱骨缺損[2]。近年來隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，數(shù)字成型鈦板修補(bǔ)已廣泛用于臨床[3]，極大的滿足了患者對自然度和美觀度的要求，但該手術(shù)后卻存在一些并發(fā)癥，極大的降低了鈦板顱骨修補(bǔ)術(shù)成功率[4]。本研究回顧我院2015年1月—2017年1月收治的80例顱骨缺損患者臨床資料，分析鈦板顱骨修補(bǔ)術(shù)后并發(fā)癥的處理及防治措施，報(bào)道如下。

1.2.3 總黃酮得率的計(jì)算

式中C—提取液中總黃酮的濃度(mg/mL)；m—樣品質(zhì)量(g)；V—提取液定容體積(mL)；n—稀釋倍數(shù).

2 結(jié)果與討論

2.1 加酶量對超聲波協(xié)同酶法提取效果的影響

取40 g經(jīng)預(yù)處理的紅棗樣品，在pH 4.5，加水量為10 mL/g，超聲波功率為200 W，溫度為45 ℃，超聲波酶解時(shí)間為60 min的條件下，考察不同加酶量對紅棗總黃酮得率的影響.

圖1 加酶量對紅棗總黃酮得率的影響 圖2 加水量對紅棗總黃酮得率的影響

由圖1可知，隨著加酶量的增加，紅棗總黃酮得率不斷提高；當(dāng)加酶量超過100 mg/100 g時(shí)總黃酮得率增加開始顯現(xiàn)出相對減緩的趨勢.這是因?yàn)楣z復(fù)合酶中果膠酶、纖維素酶和β-葡聚糖酶對植物細(xì)胞壁主要組成成分有降解作用，破壞了細(xì)胞壁，加速了黃酮化合物的溶出，從而利于紅棗中總黃酮的提取[4].

2.2 加水量對超聲波協(xié)同酶法提取效果的影響

取40 g經(jīng)預(yù)處理的紅棗樣品，在pH 4.5，加酶量為100 mg/100 g，超聲波功率為200 W，溫度為45 ℃，超聲酶解時(shí)間為60 min的條件下，考察不同加水量對紅棗總黃酮得率的影響.

由圖2可知，隨著加水量的增加，紅棗總黃酮得率不斷提高，在加水量達(dá)到14 mL/g時(shí)，總黃酮得率最大.這是由于在酶解時(shí)加水量的增加使得細(xì)胞內(nèi)外濃度差增大，有利于紅棗中總黃酮的溶出.當(dāng)加水量大于14 mL/g時(shí)，紅棗總黃酮得率反而降低.原因可能是加水量過大，降低了酶和底物的濃度，從而減少了酶分子與底物分子的碰撞幾率，使得底物未充分酶解而破壞，導(dǎo)致總黃酮的溶出效果變差.

2.3 時(shí)間對超聲波協(xié)同酶法提取效果的影響

取40 g經(jīng)預(yù)處理的紅棗樣品，在pH 4.5，加酶量為100 mg/100 g，超聲波功率為200 W，溫度為45 ℃，加水量為14 mL/g的條件下，考察不同處理時(shí)間對紅棗總黃酮得率的影響.

圖3 時(shí)間對紅棗總黃酮得率的影響 圖4 超聲波功率對紅棗總黃酮得率的影響

由圖3可知，在提取時(shí)間小于70 min時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長，紅棗總黃酮得率增加迅速.原因可能是超聲波產(chǎn)生的瞬間空化高溫和局部高壓隨時(shí)間的積累可加速紅棗中總黃酮的溶解，另外隨酶解時(shí)間的增加，蛋白酶會使細(xì)胞的破壞更完全，從而加速總黃酮的溶出.當(dāng)提取時(shí)間大于70 min后，紅棗總黃酮得率增加趨于平緩，這是因?yàn)殚L時(shí)間的超聲波處理會使酶失活，導(dǎo)致破壞細(xì)胞壁的能力下降，從而總黃酮的溶出能力下降.同時(shí)，底物含量也會不斷下降，濃度差的推動力減弱，最后總黃酮在溶劑中達(dá)到溶解平衡.

2.4 功率對超聲波協(xié)同酶法提取效果的影響

由圖4可知，隨超聲波功率增大紅棗總黃酮得率相應(yīng)提高，超聲波功率達(dá)到200 W時(shí)紅棗總黃酮得率最高.這是因?yàn)槌暡üβ试酱螅栈饔煤蜋C(jī)械作用越強(qiáng)烈，分子擴(kuò)散速度也就越大，總黃酮滲出就越多.但在超聲波功率超過200 W后，總黃酮得率反而減小.這可能是由于功率過大，超聲時(shí)瞬間熱效應(yīng)過于明顯，使得局部溫度過高導(dǎo)致蛋白質(zhì)酶變性失活，破壞細(xì)胞壁的能力喪失，從而影響了總黃酮的溶出.

2.5 溫度對超聲波協(xié)同酶法提取效果的影響

取40 g經(jīng)預(yù)處理的紅棗樣品，在pH 4.5，加酶量為100 mg/100 g，時(shí)間為70 min，微波功率為200 W，加水量為14 mL/g的條件下，考察不同溫度對紅棗總黃酮得率的影響.

圖5 溫度對紅棗總黃酮得率的影響 圖6 pH對紅棗總黃酮得率的影響

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

由圖5可知，隨著溫度的上升紅棗總黃酮得率不斷升高，當(dāng)溫度達(dá)到45～50 ℃時(shí)總黃酮得率達(dá)到最大，超過50 ℃時(shí)，隨溫度的升高總黃酮得率急速降低.這可能與果膠復(fù)合酶的最適作用溫度有關(guān)，當(dāng)酶解溫度偏離其最適溫度時(shí)不利于果膠復(fù)合酶作用，從而不利于總黃酮的提取.溫度較低時(shí)，果膠復(fù)合酶活力不能充分發(fā)揮，導(dǎo)致細(xì)胞不能被充分破壞；而溫度過高導(dǎo)致果膠復(fù)合酶失活，從而影響了細(xì)胞壁主要成分的降解，最終影響了總黃酮的提取，因此45～50 ℃為酶解的最佳溫度范圍[5].

2.6 pH對超聲波協(xié)同酶法提取效果的影響

取40 g經(jīng)預(yù)處理的紅棗樣品，在加酶量為100 mg/100 g，時(shí)間為70 min，微波功率為200 W，加水量為14 mL/g，溫度為45 ℃的條件下，考察不同pH對紅棗總黃酮得率的影響.

由圖6可知，紅棗總黃酮得率隨pH的升高而增加，在pH 4.5～5.0時(shí)總黃酮得率達(dá)到最大；當(dāng)pH超過5.0時(shí)，總黃酮得率隨pH的升高而下降.可能的原因與果膠復(fù)合酶的最適宜酶解pH有關(guān)，當(dāng)酶解pH偏離其最適pH時(shí)不利于果膠復(fù)合酶的作用，對紅棗細(xì)胞壁的分解破壞能力減弱，并對紅棗總黃酮溶出產(chǎn)生不利影響.因此，果膠復(fù)合酶最適宜pH為4.5～5.0[6].

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.7 正交試驗(yàn)優(yōu)化

在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)紅棗漿液pH在4.5～5.0之間，恰好在果膠復(fù)合酶最適宜pH范圍內(nèi)，故為了簡化實(shí)驗(yàn)過程，在正交優(yōu)化試驗(yàn)中不對pH的相應(yīng)水平進(jìn)行優(yōu)化.在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對超聲波協(xié)同果膠復(fù)合酶提取紅棗總黃酮得率影響較大的因素各水平進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，并選用L9(34)正交表，各因素水平見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析見表2.

由表2可見，超聲波協(xié)同酶法提取紅棗總黃酮得率影響因素的主次順序?yàn)椋簳r(shí)間>功率>溫度>加水量，最佳水平組合為A1B1C3D1，即加水量13 mL/g，超聲功率175 W，時(shí)間80 min，溫度40 ℃，pH 4.5，此時(shí)總黃酮的得率為2.61%，明顯高于同等工藝條件下果膠復(fù)合酶和超聲波單獨(dú)提取的效果[7].

對所得優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，即在加酶量100 mg/100 g，pH 4.5，加水量13 mL/g，超聲功率175 W，時(shí)間80 min，溫度40 ℃條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，紅棗總黃酮得率為2.72%，和正交試驗(yàn)結(jié)果基本相符.

3 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定了超聲波協(xié)同果膠復(fù)合酶提取紅棗中總黃酮的最佳工藝條件為：加酶量100 mg/100 g，pH 4.5，加水量13 mL/g，超聲功率175 W，時(shí)間80 min，溫度40 ℃，此時(shí)總黃酮的得率為2.61%.超聲波協(xié)同果膠復(fù)合酶提取紅棗中總黃酮可以提高效率，縮短浸提時(shí)間，節(jié)約成本，提高總黃酮含量，明顯優(yōu)于同類傳統(tǒng)提取方法.

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