姜春林, 匡 銘

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科，超聲介入科， 廣東 廣州 510080)

肝癌熱消融治療引起免疫增強機制的研究進(jìn)展*

姜春林, 匡 銘△

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科，超聲介入科， 廣東 廣州 510080)

肝腫瘤； 熱消融； 免疫力

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)發(fā)病率居世界最常見癌癥第5位、最常見癌癥死亡原因第3位[1]。目前根治性治療方法包括手術(shù)切除、肝移植和局部消融(熱消融、無水乙醇消融等)。治療HCC最有效的方法是外科手術(shù)切除或肝移植。然而只有20％-30％的患者能夠獲得切除的機會[2,3],供體肝的短缺又限制了肝移植的應(yīng)用，事實上絕大部分的病人需要接受非手術(shù)治療。1971年，Goldenberg等[4]對人結(jié)腸癌小鼠皮下種植模型進(jìn)行局部熱消融，發(fā)現(xiàn)腫瘤被破壞后遠(yuǎn)處的轉(zhuǎn)移灶縮小甚至消失，熱消融這種除了直接殺瘤效果之外伴發(fā)的 “異位效應(yīng)”啟發(fā)人們關(guān)注到熱消融治療和宿主免疫反應(yīng)之間的關(guān)系。熱消融治療以射頻消融(radiofrequency ablation,RFA)和微波消融(microwave ablation,MWA)應(yīng)用最為廣泛。近期有報道稱熱消融在治療原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性肝癌中能引發(fā)有效的抗腫瘤免疫效應(yīng)[5,6]。熱消融的這種既能殺傷腫瘤，同時又引起機體抗腫瘤免疫功能增強的具體機制不明，潛在機制可分為腫瘤相關(guān)和機體相關(guān)機制。

1 腫瘤相關(guān)機制

1.1腫瘤細(xì)胞變性壞死后的分解產(chǎn)物具有抗原性,同時，熱效應(yīng)改變了腫瘤細(xì)胞抗原決定簇的空間結(jié)構(gòu)[7]，從而改變其抗原性，激發(fā)機體特異性免疫應(yīng)答。此外，經(jīng)滅活的腫瘤留于體內(nèi)，形成腫瘤細(xì)胞“疫苗”，能誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞 (cytotoxic T-lymphocytes,CTL)的產(chǎn)生，增強細(xì)胞免疫功能[8]。

RFA產(chǎn)生的高溫能使肝腫瘤組織發(fā)生凝固性壞死,大量壞死組織作為抗原能夠產(chǎn)生持續(xù)性局部炎癥反應(yīng),活化抗原遞呈細(xì)胞(antigen-presenting cells,APCs),誘導(dǎo)腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞反應(yīng),改善機體抗腫瘤免疫耐受狀態(tài)[9]。譚進(jìn)富等[10]發(fā)現(xiàn)，在一定消融溫度條件下,微波消融能促進(jìn)荷肝癌小鼠機體產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞特異性免疫反應(yīng)。我們的類似研究結(jié)果[11]顯示MWA治療后的小鼠能夠?qū)笻epa1-6細(xì)胞的再接種沖擊，與對照組小鼠全部生長腫瘤相比，17％的MWA組小鼠獲得保護(hù)，腫瘤生長受到顯著抑制，小鼠的生存時間顯著延長，細(xì)胞殺傷實驗顯示，MWA組無瘤小鼠的脾細(xì)胞CTL殺傷活性顯著增強。MWA原位瘤苗(MWA后瘤內(nèi)注射免疫活性細(xì)胞因子GM-CSF和IL-2緩釋微球)保護(hù)免疫小鼠的效能比單用MWA滅活肝癌組織者高50％，與作為陽性對照的甲醛固定腫瘤瘤苗相近。因此，原位MWA能為誘導(dǎo)特異性抗腫瘤免疫提供有效抗原，免疫活性細(xì)胞因子的使用可加強該作用。Johnson等[12]的研究取得了類似的結(jié)果，他們在研究中使用RFA聯(lián)合白細(xì)胞介素-2(interleukin-2,IL-2)注射治療小鼠結(jié)腸癌后發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療能夠顯著抑制腫瘤的生長，50％的小鼠腫瘤完全消除。除了對局部腫瘤有效果外，聯(lián)合治療還能夠?qū)h(yuǎn)處腫瘤產(chǎn)生殺傷效應(yīng)，且這種反應(yīng)具有免疫記憶。

1.2熱消融治療使腫瘤組織發(fā)生凝固性壞死，降低了腫瘤細(xì)胞分泌的免疫抑制因子水平，解除或減輕了腫瘤組織的免疫抑制作用,改善了機體免疫微環(huán)境抑制。

腫瘤細(xì)胞分泌的可溶性IL-2受體(sIL-2R)能中和活化T淋巴細(xì)胞分泌的IL-2，作用類似封閉因子，能使肝癌患者的IL-2水平降低。微波和射頻消融治療后患者的sIL-2R下降，與治療前相比顯著降低[13,14]。

細(xì)胞膜表面腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor,TNFR)在蛋白水解酶作用下快速裂解脫落形成的胞外活性片段sTNFR可以通過與膜TNFR競爭結(jié)合而抑制TNF活性。細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecular-1,ICAM-1)是淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(lymphocyte function-associated antigen,LFA-1)和巨噬細(xì)胞表面抗原-1(macrophage surface antigen-1,Mac-1)的配體，可以介導(dǎo)細(xì)胞的遷移和激活，sTNFR的產(chǎn)生直接導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞膜TNFR數(shù)目減少，并抑制TNF的多種抗腫瘤活性，而ICAM-1則抑制了淋巴細(xì)胞的黏附與浸潤?；颊唧w內(nèi)高水平sTNFR和ICAM-1除由機體免疫細(xì)胞受腫瘤抗原刺激產(chǎn)生外，有部分為腫瘤細(xì)胞本身所釋放，這可能是腫瘤細(xì)胞逃避機體免疫的機制之一。龐志剛等[15]對42例HCC病人實施RFA治療，其研究中發(fā)現(xiàn)RFA后HCC患者血漿sTNFR-1和ICAM-1較治療前顯著降低，表明RFA在一定程度上改善了HCC患者的免疫功能狀態(tài)和抗腫瘤能力。

轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)也是腫瘤細(xì)胞分泌的免疫抑制因子之一，能抑制多種抗腫瘤免疫效應(yīng)。Terabe等[16]通過聯(lián)合應(yīng)用CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤疫苗和TGF-β單克隆抗體治療小鼠肺癌模型發(fā)現(xiàn)，單獨應(yīng)用TGF-β單克隆抗體清除TGF-β并不能產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)，但是聯(lián)合應(yīng)用CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤疫苗時卻能顯著增強該疫苗的作用，提示TGF-β阻斷可能在提高腫瘤疫苗的效用方面是有幫助的。王月香等[17]的研究表明，WMA治療可以使患者外周血中的TGF-β1短期升高，但1周后，已明顯低于治療前的水平。影像學(xué)檢查在腹腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)了新生病灶的患者，WMA治療前、后血清中TGF-β1無明顯變化。作者認(rèn)為肝癌微波凝固治療前后血清TGF-β1的檢測對于術(shù)前肝癌診斷及術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有一定的診斷價值。

甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)是肝癌細(xì)胞分泌的特征性蛋白標(biāo)志，也具有免疫抑制作用，它能抑制樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)的分化和成熟，并能誘導(dǎo)其凋亡。肝癌周圍組織的AFP水平明顯增高，浸潤的DCs接觸到高濃度的AFP導(dǎo)致DCs分泌的IL-2和腫瘤壞死因子α(TNF-α)明顯減少，表達(dá)的協(xié)同刺激分子水平降低，DCs免疫功能降低，而DCs是功能最強的抗原呈遞細(xì)胞，在抗原加工、呈遞、細(xì)胞因子分泌和免疫細(xì)胞激活等過程中起重要作用[18]。熱消融后的腫瘤細(xì)胞分泌AFP減少或喪失，因而對DCs的免疫抑制功能相應(yīng)消退。

2 機體相關(guān)機制

2.1機體在應(yīng)激條件(熱刺激)下合成的熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)激活機體抗腫瘤免疫功能 HSP70的表達(dá)可影響APCs將腫瘤抗原提呈給CD4+T細(xì)胞[19,20]，Wells等[21]認(rèn)為HSP70可能通過增加MHC-I類分子的表達(dá)從而促進(jìn)腫瘤表面多肽的提呈。Dressel等[22]發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞HSP70表達(dá)增加還可以促進(jìn)T細(xì)胞對其的識別。熱消融能夠引起體內(nèi)HSP70合成增加從而增加腫瘤細(xì)胞的免疫原性，同時熱消融可以誘導(dǎo)細(xì)胞表面表達(dá)更多的HSP并且使其釋放增加[23-25]。Chen等[26]證實了腫瘤細(xì)胞在熱消融時釋放的HSP70對抗腫瘤免疫的產(chǎn)生起著重要作用。作者認(rèn)為熱消融可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞釋放HSP70。HSP70一方面以自分泌方式促進(jìn)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，另一方面以旁分泌方式激活細(xì)胞因子所吸引的DCs，DCs被激活后遷移到脾臟或淋巴結(jié)時可以捕獲與HSP70伴隨的腫瘤抗原并將其提呈給初始T細(xì)胞。該研究進(jìn)一步證實HSP70是通過TLR4信號途徑活化DCs，這一結(jié)果證實了熱消融治療時HSP70的釋放對抗腫瘤免疫的產(chǎn)生起著重要作用。Schueller等[27]通過對12只裸鼠接種人HCC細(xì)胞(SK-HEP-1)建立肝癌模型，對21個腫瘤進(jìn)行RFA治療，監(jiān)測RFA治療前后裸鼠體內(nèi)HSP70和HSP90的水平發(fā)現(xiàn)，RFA治療前后體內(nèi)HSP70和HSP90明顯升高(治療前HSP70和HSP90表達(dá)率分別是0％和0-30％，治療后最大表達(dá)率分別為60％和100％),提示RFA能夠促進(jìn)HSP70和HSP90的表達(dá)。在其臨床試驗中G.Schueller等[28]對HCC病人RFA治療前后病理標(biāo)本進(jìn)行免疫組化，觀察消融前后腫瘤組織的HSP70與HSP90的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)消融前后，胞質(zhì)和腫瘤細(xì)胞表面HSP70增加了8倍，HSP90增加了1.2倍，而在細(xì)胞核中，消融前HSP90的表達(dá)率為10％，消融后降為0％。由此表明HCC病人經(jīng)過RFA治療后能夠增加HSP70與HSP90的表達(dá)。HSP不僅能夠作為分子伴侶在細(xì)胞修復(fù)方面起重要的作用，同時，它們在免疫系統(tǒng)中也行使重要的功能。例如HSP能夠通過模式識別受體(PPRs)與DC結(jié)合并且通過CD91[29,30]、清道夫受體A[31]、CD40[32]、凝集素樣氧合低密度脂蛋白受體1[33]以及TLR2/4[34]等受體經(jīng)由受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用而內(nèi)化。

HSP對機體免疫功能的作用包括特異性免疫與非特異性免疫兩方面。

在特異性免疫中，HSP能與細(xì)胞內(nèi)各種抗原多肽以非共價結(jié)合形成HSP-多肽復(fù)合物，溢出細(xì)胞外后比游離抗原能更快速而高效地被抗原提呈細(xì)胞內(nèi)吞并呈遞到MHC-I分子上，在此過程中，HSP起到穩(wěn)定抗原肽段、輔助分子裝配和轉(zhuǎn)運的重要作用[35]。HSP還具有獨立的腫瘤特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞抗原決定簇，并能直接提呈腫瘤抗原，該作用不受MHC-1分子限制。另外，HSP還能直接激活γδ T細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤免疫。HSP是激活抗腫瘤免疫反應(yīng)的重要佐劑[36]，細(xì)胞膜HSP72表達(dá)增加能增加腫瘤細(xì)胞的免疫原性，在體外能顯著誘導(dǎo)γδT細(xì)胞增殖并提高其殺傷活力。HSPs通過DCs細(xì)胞膜上的共同受體將所攜帶的腫瘤特異抗原肽傳遞到細(xì)胞內(nèi)部，然后再呈遞到細(xì)胞表面，從而激活腫瘤殺傷細(xì)胞的免疫反應(yīng)，也增加了抗原特異性的記憶性CD4+T細(xì)胞的增殖[29,37]。

在非特異性免疫中，HSP能直接激活抗原提呈細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，還可以刺激巨噬細(xì)胞分泌IL-1β、IL-12、TNF-α和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)。HSP能直接激活CD4+T細(xì)胞，使其分泌ThI類細(xì)胞因子，HSP還能激活自然殺傷細(xì)胞。另外，HSP本身也具有細(xì)胞因子作用。單核細(xì)胞亞致死溫度刺激后8-16 h，HSP70釋放到細(xì)胞外，能作為一種細(xì)胞因子刺激免疫活性細(xì)胞上調(diào)IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)，證明HSP70有分子伴侶和細(xì)胞因子的雙重作用。然而也有不同意見，有的研究資料表明HSP可能也有負(fù)相免疫調(diào)控作用。HSP27能誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌IL-10增加，導(dǎo)致TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡下調(diào)，誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫耐受[38]。

2.2消融治療提高了淋巴細(xì)胞免疫功能 樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)是專職的抗原遞呈細(xì)胞,在抗腫瘤細(xì)胞免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Ali等[39]報道射頻消融治療HCC的局部熱效應(yīng)可以使單核細(xì)胞活化,分泌多種細(xì)胞因子,RFA治療后7 d患者血清TNF-α和IL-1β升高,14 d達(dá)高峰,殺傷腫瘤細(xì)胞釋放內(nèi)源性激活物通過激活骨髓樹突細(xì)胞(MDC)增強抗腫瘤免疫反應(yīng)。Wissniowski等[40]對11例家兔VX2肝癌模型行RFA治療后，都在觀察期內(nèi)產(chǎn)生了具有腫瘤抗原特異性的活化T細(xì)胞，同時伴有大量的T細(xì)胞浸潤。在對照組中荷瘤家兔中的T細(xì)胞沒有活化，其T細(xì)胞浸潤也很稀少。表明RFA能夠使機體產(chǎn)生針對腫瘤抗原的特異性T細(xì)胞反應(yīng)。Hansler等[41]通過研究證實原發(fā)性和繼發(fā)行肝癌患者經(jīng)過RFA治療后，體內(nèi)會出現(xiàn)具有腫瘤特異性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞的顯著增殖。此外有研究表明，消融前后淋巴細(xì)胞的分布會發(fā)生變化。免疫細(xì)胞浸潤程度的個體差異較大，但在同一個體，肝癌病灶被膜下的免疫細(xì)胞浸潤程度大于癌周肝組織和肝癌病灶。其中以肝癌組織內(nèi)部免疫細(xì)胞浸潤程度最低，提示肝癌患者病灶局部雖然有免疫活性細(xì)胞浸潤，但局限于肝癌的被膜下及癌周肝組織，而癌組織內(nèi)明顯低下[42]，熱凝固治療后,凝固壞死組織內(nèi)未見淋巴細(xì)胞浸潤分布,淋巴細(xì)胞(以CD8+T細(xì)胞占優(yōu)勢)主要分布在癌灶與正常組織交界的炎性反應(yīng)區(qū)[43]。趙齊羽等[44]通過對20例行射頻消融治療的患者分別于治療前1 d、治療14 d和28 d時應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢查患者外周血CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值、NK細(xì)胞數(shù)，發(fā)現(xiàn)RFA后第2周及第4周，CD4+值比術(shù)前明顯上升，CD8+明顯下降，NK細(xì)胞水平在RFA治療后第4周顯著高于治療前，血清TGF-β水平顯著高于對照組，提示RFA治療后患者免疫功能得到顯著改善，對肝癌的預(yù)后起到重要作用。李金茂等[45]通過檢測112例HCC患者RFA治療前后血清中TNF和AFP的改變，并與健康對照組20例比較發(fā)現(xiàn)HCC病人RFA治療后血清TNF和AFP水平下降，提示機體免疫功能增強。劉大全等[46]對腫瘤進(jìn)行微波消融或手術(shù)切除， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)MWA組與手術(shù)組CD8+、CD4+T細(xì)胞及IL-2、IFN-γ 、IL-10無明顯區(qū)別，NK1.1細(xì)胞和IL-12明顯上升，證明MWA原位滅活小鼠肝癌可促進(jìn)Th2/Thl偏移及NK細(xì)胞組成的顯著升高。朱忠超等[47]觀察肝癌小鼠模型射頻治療后外周血TNF-α和IL-2的變化及癌組織CD54的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)消融小鼠TNF-α和IL-2濃度呈遞增趨勢，與對照組比較差異顯著，并上調(diào)細(xì)胞間黏附分子CD54的表達(dá)，從而誘導(dǎo)腫瘤免疫應(yīng)答而發(fā)揮作用。

近年來，隨著肝癌原位治療方法的創(chuàng)新和發(fā)展，肝癌原位治療方法也越來越受到人們的重視，并且成為早期肝癌治療的首選方法之一。以射頻消融為代表的熱消融有以下優(yōu)點：(1)安全、價廉、易于在門診操作，可有效原位滅活腫瘤組織；(2)根據(jù)病情特點治療范圍可控，易重復(fù)治療，部分方法療效及生存率與手術(shù)切除相近；(3)對肝功能損害較輕，有利于患者機體恢復(fù)等[48]。與手術(shù)相比，消融不僅能夠達(dá)到對腫瘤組織的殺傷，同時還能夠提高機體的抗腫瘤免疫，在一定程度上抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)。隨著細(xì)胞免疫學(xué)、生物工程、基因技術(shù)的迅速發(fā)展，醫(yī)學(xué)界對于腫瘤免疫原理的認(rèn)識有了巨大突破，腫瘤免疫療法正日益受到重視。如何能使消融治療與免疫治療更好地結(jié)合，使機體產(chǎn)生更有效的抗腫瘤免疫以減少肝癌復(fù)發(fā)，是我們未來的研究方向。

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Advancesinmechanismsofimmunityenhancementinducedby
thermalablationtherapyinhepatocellularcarcinoma

JIANG Chun-lin,KUANG Ming
(DepartmentofHepatobiliarySurgery,DivisionofInterventionalultrasound,TheFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,
Guangzhou510080,China.E-mail:kuangminda@hotmail.com)

Image-guided tumor thermal ablation plays a key role in the management of hepatocellular carcinoma.Thermal ablation for hepatic tumors not only generates directly killing effect on liver tumors,but also improves the level of anti-tumor immunity of the host.Thermal ablation potentially affects the anti-tumor immunity in the following ways: (1) causing necrosis that is a source for intracellular antigens,and also inducing local inflammation,which further stimulates the antigen-presenting cells; (2) removing the tumor burden; (3) undergoing the process of heat shock in surviving tissue,leading to increase in the expression of heat shock proteins; (4) activating and enhancing tumor-specific T-cell responses.This review discusses these possible mechanisms.

Liver neoplasms; Thermal ablation; Immunity

1000-4718(2011)05-1020-05

R730.3

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.037

2010-09-18

2011-03-16

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81071892;No.30872486)；廣東省自然科學(xué)基金資助項目(No．8151008901000211)

△通訊作者 Tel: 020-87755766-8214; E-mail: kuangminda@hotmail.com