楊 曉

（蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所發(fā)育和疾病遺傳學(xué)研究室，北京 100071）

盡管基因打靶技術(shù)的先驅(qū)者2007年才獲得諾貝爾生物學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，基因打靶技術(shù)在現(xiàn)代生物學(xué)研究中的應(yīng)用卻已經(jīng)有25年的時(shí)間?；虼虬屑夹g(shù)的發(fā)明和應(yīng)用革命性地改變了現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究的面貌，催生了許多生物醫(yī)學(xué)和藥物研發(fā)領(lǐng)域的前沿研究，并直接導(dǎo)致了生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的許多突破性進(jìn)展。基因打靶技術(shù)的發(fā)明使得科學(xué)家第一次能對關(guān)于特定基因生理功能的假設(shè)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，并通過基因打靶研究真正建立基因和疾病間的因果關(guān)系。近年來，基因打靶技術(shù)在現(xiàn)代生物學(xué)研究中的應(yīng)用日益深入和廣泛。本文將簡要介紹相關(guān)領(lǐng)域的部分新進(jìn)展，以及我們實(shí)驗(yàn)室在利用基因打靶技術(shù)研究轉(zhuǎn)化生長因子-β信號(hào)通路維持組織穩(wěn)態(tài)和抑制疾病發(fā)生的生理功能和機(jī)制方面的新發(fā)現(xiàn)。

1 基因打靶技術(shù)在基因組功能研究中的應(yīng)用

在過去的二十年中，基因打靶技術(shù)已經(jīng)幫助研究者揭示了大約5000種哺乳動(dòng)物基因的生理功能［1］。這些研究極大地促進(jìn)了人類對哺乳動(dòng)物發(fā)育和穩(wěn)態(tài)維持過程中生理和病理現(xiàn)象及其調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)。從來沒有一種技術(shù)像基因打靶技術(shù)這樣全面而深刻地影響了幾乎所有生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的進(jìn)展。僅以近兩年為例，通過對組織特異性表達(dá)活化型RAS突變體轉(zhuǎn)基因小鼠以及多種基因敲除小鼠的分析，Tang等研究者發(fā)現(xiàn)RAS調(diào)節(jié)的ERK1/2通路通過控制有絲分裂紡錘體角度決定肺管的形狀［2］。Fujiwara等人通過對nephronectin基因敲除小鼠的研究，發(fā)現(xiàn)毛囊膨隆處的干細(xì)胞通過表達(dá)nephronectin創(chuàng)造平滑肌細(xì)胞的niche，并行使立毛肌肌腱細(xì)胞的功能［3］。多個(gè)課題組通過對Pdgfrb基因敲除小鼠的研究，發(fā)現(xiàn)了周細(xì)胞維持血腦屏障的重要生理功能［4，5］。Goetz等人通過對caveolin-1基因敲除小鼠的研究，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞中的caveolin-1通過調(diào)節(jié)微環(huán)境生物應(yīng)力重塑促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移［6］。

近年來，基因敲除技術(shù)開始揭示細(xì)胞內(nèi)一種重要的非編碼RNA-miRNA在哺乳動(dòng)物發(fā)育和穩(wěn)態(tài)維持過程中的生理功能。miRNA是一種大小約為21～23個(gè)堿基的單鏈小分子RNA，由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70～90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成［7］。這些非編碼小分子RNA與靶基因mRNA分子的3’端非編碼區(qū)域（3’UTR）或者編碼區(qū)互補(bǔ)配對后，主要通過降低mRNA分子穩(wěn)定性和翻譯抑制兩種方式參與靶基因表達(dá)調(diào)控［8，9］。miRNA基因敲除小鼠的研究結(jié)果顯示，miRNA能夠決定特定發(fā)育過程的轉(zhuǎn)換，但更多的時(shí)候?qū)μ囟òl(fā)育過程或者細(xì)胞功能起到精細(xì)調(diào)節(jié)的作用［10，11］。相當(dāng)數(shù)量的miRNA基因敲除小鼠沒有易觀察的表型，或者僅在應(yīng)激或者損傷時(shí)表現(xiàn)出與野生型不同［12-14］。可以預(yù)期，未來更多miRNA或者其他非編碼RNA基因打靶小鼠的研制和分析將有助于解析非編碼RNA的作用模式及其生理功能。

為了高效而迅速地解析全基因組編碼基因的生理功能，研究者一直致力于全基因組誘變策略的探索。用于小鼠全基因組誘變的策略和技術(shù)方法包括ENU化學(xué)誘變、轉(zhuǎn)座子誘變和基因誘捕。利用基因誘捕構(gòu)建的隨機(jī)插入誘變的胚胎干細(xì)胞，大約覆蓋基因組中一半的編碼基因。然而，基因誘捕等位基因無法被精確設(shè)計(jì)，且在胚胎干細(xì)胞中表達(dá)的基因更容易中靶。

近年來，條件基因打靶技術(shù)因?yàn)槟軌驅(qū)虼虬羞M(jìn)行時(shí)間和空間上的精確調(diào)控，迅速取代了傳統(tǒng)的完全基因敲除技術(shù)，成為在生物整體水平上進(jìn)行基因和基因組功能研究的主流。為了克服基因誘捕技術(shù)的缺陷，研究者建立了高通量的條件基因打靶策略，構(gòu)建全基因組范圍內(nèi)所有編碼基因的報(bào)告基因標(biāo)記的條件基因打靶等位基因。迄今為止，已經(jīng)構(gòu)建了12000打靶載體，篩選到9000種條件中靶C57BL/6N胚胎干細(xì)胞［1］。通過囊胚注射檢測了數(shù)百種中靶胚胎干細(xì)胞整合到生殖系的能力，結(jié)果顯示65％的中靶胚胎干細(xì)胞可以整合到嵌合體小鼠的生殖系［15］。這種高通量的條件基因敲除小鼠資源庫的構(gòu)建為研究者在動(dòng)物整體水平上解析基因功能提供了便利，也為高通量大規(guī)模表型分析提供了可能性。

2 基因打靶技術(shù)在人類疾病模型研究中的應(yīng)用

遺傳修飾小鼠疾病模型的應(yīng)用極大地推動(dòng)了轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展。通過基因打靶技術(shù)研制的人類疾病小鼠模型保守估計(jì)也有數(shù)百種。通過對人類疾病小鼠模型的表型研究，可以揭示疾病發(fā)生的病理學(xué)和分子機(jī)制；可以快速解析各種編碼基因以及非編碼基因在疾病病理過程中的作用及其機(jī)制，為相關(guān)疾病的預(yù)防、診斷和治療提供分子靶標(biāo)。同時(shí)，人類疾病小鼠模型也可以作為藥物篩選與評價(jià)的強(qiáng)有力的工具。例如，最近研究者通過對p63基因敲除小鼠的研究，發(fā)現(xiàn)食管癌的癌前病變Barrett食管起源于一種獨(dú)特的胚胎上皮細(xì)胞。這種上皮細(xì)胞位于鱗狀上皮和柱狀上皮的交界處，鱗狀上皮的損傷將誘發(fā)這種上皮細(xì)胞向相鄰的特化的鱗狀細(xì)胞遷移，并發(fā)展為Barrett食管。這一發(fā)現(xiàn)為理解食管癌的發(fā)生提供了全新的病理機(jī)制［16］。利用人類疾病小鼠模型結(jié)合高通量篩選技術(shù)發(fā)現(xiàn)了很多疾病的診斷標(biāo)志分子。研究者利用PTEN基因敲除導(dǎo)致前列腺癌的小鼠模型高通量篩選差異分子，發(fā)現(xiàn)TGFβ/BMP-SMAD4信號(hào)通路激活。進(jìn)一步敲除Smad4導(dǎo)致前列腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移。深入研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)cyclin D1，SPP1，PTEN和SMAD4可以作為前列腺癌發(fā)生和致命轉(zhuǎn)移的診斷標(biāo)志分子［17］。研究者最近還報(bào)道了利用小鼠模型成功地篩選到可用于阿爾茨海默病診斷的候選IgG生物標(biāo)志分子［18］。利用一種遺傳修飾的急性髓性白血病小鼠模型，研究者從shRNAs文庫中篩選到并確定Brd4（bromodomain-containing 4）可作為有效治療白血病的靶分子。抑制Brd4表達(dá)促進(jìn)髓系終末分化并消除白血病干細(xì)胞［19］。這一研究又一次確證了人類疾病小鼠模型在藥物篩選中的價(jià)值。利用一種血友病B小鼠模型，研究者證實(shí)鋅指核酶能夠在小鼠肝臟中介導(dǎo)特異位點(diǎn)的基因置換，有效改善疾病癥狀［20］。該研究顯示有可能通過基因組編輯治療遺傳病，這為血友病以及其他遺傳病的治療提供了一種全新的可能性。研究者利用Pdx1基因敲除導(dǎo)致胰腺發(fā)育不全的小鼠，在其囊胚中注射大鼠多能干細(xì)胞，成功地在嵌合體小鼠體內(nèi)發(fā)育成了正常行使功能的大鼠胰腺［21］。這一研究證實(shí)可以通過種間囊胚補(bǔ)償在異種生理環(huán)境下獲得供體多能干細(xì)胞來源的組織器官，為干細(xì)胞治療提供了激動(dòng)人心的新機(jī)會(huì)。

基因打靶在除小鼠之外的模式生物中也陸續(xù)獲得成功，為研制更理想的人類疾病動(dòng)物模型提供了新的機(jī)會(huì)。長期以來，因?yàn)槿狈δ苓M(jìn)種系的大鼠胚胎干細(xì)胞，利用同源重組技術(shù)對大鼠的基因組進(jìn)行修飾一直沒有獲得成功。直到最近，研究者才報(bào)道了腫瘤抑制基因p53基因敲除大鼠的研制和鑒定［22］。結(jié)合大鼠在生理學(xué)和藥理學(xué)研究方面的優(yōu)勢，基因敲除大鼠將為人類深刻理解疾病發(fā)生的病理和分子機(jī)制提供新的平臺(tái)。

3 TGF-β信號(hào)通路維持組織穩(wěn)態(tài)的生理功能和機(jī)制

我們實(shí)驗(yàn)室近年來一直研究TGF-β/Smad4信號(hào)通路維持組織穩(wěn)態(tài)抑制疾病的生理功能和機(jī)制。首先，我們建立了基于Cre-LoxP系統(tǒng)的小鼠條件基因打靶技術(shù)平臺(tái)，自主研制了13種組織特異性表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠［23-47］，包括在國際上首先報(bào)道的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞［23，24］、肥大型軟骨細(xì)胞［25］和胃頂細(xì)胞［26］特異性表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠，以及在國內(nèi)首先研制的血管內(nèi)皮細(xì)胞［28，29］、平滑肌細(xì)胞［29，30］、心肌細(xì)胞［31，32］、肺上皮細(xì)胞［23］、胃上皮壁細(xì)胞［33］、角質(zhì)細(xì)胞［34-37］、胰腺細(xì)胞［38］、肝細(xì)胞［39］、成骨細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞［40-43］、早期成骨細(xì)胞［44］、軟骨細(xì)胞［45-47］表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠。利用組織特異性條件基因敲除技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了Smad4通過調(diào)節(jié)組織干細(xì)胞動(dòng)員和自我更新、細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞-細(xì)胞間相互作用，抑制皮膚癌、食管癌、骨質(zhì)疏松、心肌肥厚、顱內(nèi)出血等疾病的重要生理功能和機(jī)制［23-47］。

最近，我們報(bào)道了世界上首例腦血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性條件基因敲除小鼠的研制和分析［24］。通過對腦血管內(nèi)皮細(xì)胞Smad4基因敲除導(dǎo)致顱內(nèi)出血小鼠模型的表型分析，闡明了腦血管內(nèi)皮-周細(xì)胞相互作用維持血腦屏障和腦血管穩(wěn)態(tài)的重要生理功能及其調(diào)控機(jī)制，為理解新生兒顱內(nèi)出血和成人腦中風(fēng)的發(fā)生機(jī)制提供了全新的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。此前的研究雖然揭示了周細(xì)胞維持血腦屏障和微血管穩(wěn)定性的生理功能，然而，人們對內(nèi)皮細(xì)胞-周細(xì)胞相互作用的遺傳調(diào)控機(jī)制仍然知之甚少。我們的研究顯示，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞Smad4缺失的小鼠因顱內(nèi)出血死于圍產(chǎn)期。該小鼠腦血管的通透性顯著增強(qiáng)，其血腦屏障功能下降。腦血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力顯著增加，其特化和分化正常，但與周細(xì)胞不能緊密接觸，造成血管擴(kuò)張和血管瘤的形成。體外的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)內(nèi)皮細(xì)胞的Smad4信號(hào)缺失導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞-周細(xì)胞的相互作用缺陷。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，Smad4通過與Notch的胞內(nèi)段共同結(jié)合在N-cadherin啟動(dòng)子的RBP-J結(jié)合位點(diǎn)發(fā)揮對N-cadherin的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而穩(wěn)定腦血管內(nèi)皮細(xì)胞-周細(xì)胞的相互作用并維持腦血管的完整性。

我們的工作還揭示了受TGF-β信號(hào)調(diào)節(jié)的非編碼小RNA調(diào)節(jié)成肌分化和心臟穩(wěn)態(tài)的功能和機(jī)制，為理解TGF-β信號(hào)維持組織穩(wěn)態(tài)的生理功能提供了新的表觀遺傳機(jī)制［48，49］。我們利用心肌細(xì)胞特異性Smad4基因敲除導(dǎo)致心肌肥厚小鼠的心臟及其對照小鼠的心臟通過miRNA芯片雜交進(jìn)行差異miRNA篩選，發(fā)現(xiàn)miR-24、miR-27b等miRNA在心肌肥厚小鼠心臟組織中表達(dá)顯著上調(diào)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)miR-24在成肌分化過程中顯著上調(diào)并能被TGF-β1所抑制，并證明了miR-24在調(diào)節(jié)TGF-β1依賴的成肌分化抑制作用中的關(guān)鍵功能［48］。體外體內(nèi)的研究結(jié)果都證明miR-27b過表達(dá)導(dǎo)致心肌肥厚。體外實(shí)驗(yàn)顯示miR-27b的表達(dá)能被TGF-β1。miR-27b過表達(dá)導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大性生長，而降低miR-27b表達(dá)可以顯著抑制由苯腎上腺素（PE）或者miR-27b過表達(dá)導(dǎo)致的心肌細(xì)胞肥大性生長。進(jìn)一步動(dòng)物整體水平的研究結(jié)果表明，心肌細(xì)胞特異性表達(dá)miR-27b足以誘發(fā)轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生心臟肥大和功能失調(diào)。分子機(jī)制上，發(fā)現(xiàn)miR-27b直接靶向過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）從而促進(jìn)心肌肥大。特別有意義的是，在一種壓力負(fù)荷導(dǎo)致心肌肥厚的小鼠模型中用antagomir阻斷miR-27b的表達(dá)可以顯著上調(diào)PPAR-β的表達(dá)，減輕心臟肥大和功能失調(diào)。這些結(jié)果證明了受TGF-β信號(hào)通路調(diào)節(jié)的miR-27b在心肌肥厚中的作用，并提示miR-27b可作為心臟肥大治療的有效靶標(biāo)［49］。

這些在動(dòng)物整體水平上開展的系統(tǒng)研究，證明了TGF-β/Smad4重要信號(hào)通路失調(diào)導(dǎo)致組織穩(wěn)態(tài)失衡及其與疾病發(fā)生間的因果聯(lián)系，為理解多種重要疾病的發(fā)生機(jī)制奠定了新的理論基礎(chǔ)。

［1］Skarnes WC，Rosen B，West AP，Koutsourakis M，Bushell W，Iyer V，Mujica AO，Thomas M，Harrow J，Cox T，Jackson D，Severin J，Biggs P，F(xiàn)u J，Nefedov M，de Jong PJ，Stewart AF，Bradley A：A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function［J］.Nature，2011，474（7351）：337-342.

［2］Tang N，Marshall WF，McMahon M，Metzger RJ，Martin GRScience：Control of mitotic spindle angle by the RAS-regulated ERK1/2 pathway determines lung tube shape［J］.2011，333（6040）：342-345.

［3］Fujiwara H，F(xiàn)erreira M，Donati G，Marciano DK，Linton JM，Sato Y，Hartner A，Sekiguchi K，Reichardt LF，Watt FM：The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche［J］.Cell，2011，144（4）：577-589.

［4］Armulik A，Genové G，M?e M，Nisancioglu MH，Wallgard E，Niaudet C，He L，Norlin J，Lindblom P，Strittmatter K，Johansson BR，Betsholtz C：Pericytes regulate the blood-brain barrier［J］.Nature，2010，468（7323）：557-561

［5］Daneman R，Zhou L，Kebede AA，Barres BA：Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis［J］.Nature，2010，468（7323）：562-566.

［6］Goetz JG，Minguet S，Navarro-Lérida I，Lazcano JJ，Samaniego R，Calvo E，Tello M，Osteso-Ibá?ez T，Pellinen T，Echarri A，Cerezo A，Klein-Szanto AJ，Garcia R，Keely PJ，Sánchez-MateosP，Cukierman E，DelPozo MA：Biomechanical remodeling of the microenvironment by stromal caveolin-1 favors tumor invasion and metastasis［J］.Cell，2011，146（1）：148-163.

［7］Carthew RW，SontheimerEJ：Originsand mechanismsof miRNAs and siRNAs［J］.Cell，2009，136：642-655.

［8］Bushati N and Cohen SM：microRNA functions［J］.Annu Rev Cell Dev Biol，2007，23：175-205.

［9］Elcheva I，Goswami S，Noubissi FK and Spiegelman VS：CRDBP Protects the Coding Region of bTrCP1 mRNA from miR-183-Mediated Degradation［J］.Molecular Cell，2009，35：240-246.

［10］van Rooij E，Sutherland LB，Qi X，Richardson JA，Hill J and Olson EN：Control of stress-dependent cardiac growth and gene expression by a microRNA［J］.Science，2007，316：575-579.

［11］Rodriguez A，Vigorito E，Clare S，Warren MV，Couttet P，Soond DR，van Dongen S，Grocock RJ，Das PP，Miska EA et al：Requirementofbic/microRNA-155 fornormalimmune function［J］.Science，2007，316：608-611.

［12］Liu N，Bezprozvannaya S，Williams AH，Qi X，Richardson JA，Bassel-DubyR and Olson EN：microRNA-133a regulates cardiomyocyte proliferation and suppresses smooth muscle gene expression in the heart［J］.Genes Dev，2008，22：3242-3254.

［13］Williams AH，Valdez G，Moresi V，Qi X，McAnally J，Elliott JL，Bassel-Duby R，Sanes JR and Olson EN：MicroRNA-206 delays ALS progression and promotes regeneration of neuromuscular synapses in mice［J］.Science，2009，326：1549-1554

［14］Jin ZB，Hirokawa G，Gui L，Takahashi R，Osakada F，Hiura Y，Takahashi M，Yasuhara O and Iwai N：Targeted deletion of miR-182，an abundant retinal microRNA［J］.Mol Vis，2009，15：523-533.

［15］Prosser HM，Koike-Yusa H，Cooper JD，Law FC，Bradley A：A resource of vectors and ES cells for targeted deletion of microRNAs in mice［J］.Nat Biotechnol，2011，Epub ahead of print

［16］Wang X，Ouyang H，Yamamoto Y，Kumar PA，Wei TS，Dagher R，Vincent M，Lu X，Bellizzi AM，Ho KY，Crum CP，Xian W，McKeon F：Residual embryonic cells as precursors of a Barrett’slike metaplasia［J］.Cell，2011，145（7）：1023-1035.

［17］Ding Z，Wu CJ，Chu GC，Xiao Y，Ho D，Zhang J，Perry SR，Labrot ES，Wu X，Lis R，Hoshida Y，Hiller D，Hu B，Jiang S，Zheng H，Stegh AH，Scott KL，Signoretti S，Bardeesy N，Wang YA，Hill DE，Golub TR，Stampfer MJ，Wong WH，Loda M，Mucci L，Chin L，DePinho RA：SMAD4-dependent barrier constrains prostate cancer growth and metastatic progression.Nature，2011，470（7333）：269-273.

［18］Reddy MM，Wilson R，Wilson J，Connell S，Gocke A，Hynan L，German D，Kodadek T：Identification of candidate IgG biomarkers forAlzheimer’sdisease via combinatoriallibrary screening［J］.Cell，2011，144（1）：132-142.

［19］Zuber J，Shi J，Wang E，Rappaport AR，Herrmann H，Sison EA，Magoon D，Qi J，Blatt K，Wunderlich M，Taylor MJ，Johns C，Chicas A，Mulloy JC，Kogan SC，Brown P，Valent P，Bradner JE，Lowe SW，Vakoc CR：RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia［J］.Nature，2011，Epub ahead of print

［20］Li H，Haurigot V，Doyon Y，Li T，Wong SY，Bhagwat AS，Malani N，Anguela XM，Sharma R，Ivanciu L，Murphy SL，F(xiàn)inn JD，Khazi FR，Zhou S，Paschon DE，Rebar EJ，Bushman FD，Gregory PD，Holmes MC，High KA：In vivo genome editing restores haemostasis in a mouse model of haemophilia［J］.Nature，2011，475（7355）：217-221.

［21］Tong C，Li P，Wu NL，Yan Y，Ying QL：Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells［J］.Nature，2010，467（7312）：211-213.

［22］Kobayashi T，YamaguchiT，HamanakaS，Kato-ItohM，Yamazaki Y，Ibata M，Sato H，Lee YS，Usui J，Knisely AS，Hirabayashi M and Nakauch H：Generation of rat pancreas in mouse by interspecific blastocyst injection of pluripotent stem cells［J］，Cell，2010，142：787-799.

［23］Meng F，Shi L，Cheng X，Hou N，Wang Y，Teng Y，Meng A，Yang X：Surfactant protein A promoter directs the expression of Cre recombinasein brain microvascularendothelialcells of transgenic mice［J］.Matrix Biol，2007，26（1）：54-57.

［24］Li F，Lan Y，Wang Y，Wang J，Yang G，Meng F，Han H，Meng A，Wang Y and Yang X：Endothelial Smad4 maintains cerebrovascular integrity by activating N-cadherin through cooperation with Notch［J］.Dev Cell，2011，15；20（3）：291-302.

［25］Yang G，Cui F，Hou N，Cheng X，Zhang J，Wang Y，Jiang N，Gao X，Yang X：Transgenic mice that express Cre recombinase in hypertrophic chondrocytes［J］.Genesis，2005，42（1）：33-36.

［26］Zhao Z，Sun Y，Hou N，Teng Y，Wang Y，Yang X：Capn8 promoter directs the expression of Cre recombinase in gastric pit cells of transgenic mice［J］.Genesis，2009，47（10）：674-679.

［27］Li WL，Cheng X，Tan XH，Zhang JS，Sun YS，Chen L，Yang X：Endothelial cell-specific expression of Crereco mbinase in transgenic mice［J］，Acta Genetica Sinica，2005，32（9）：909-915.

［28］Lan Y，Liu B，Yao H，Li F，Weng T，Yang G，Li W，Cheng X，Mao N，Yang N：Essential role of endothelial Smad4 in vascular remodeling and integrity［J］.Mol Cell Biol，2007，27（21）：7683-7692.

［29］楊蕾蕾，吳壯，程萱，徐軍，楊曉：平滑肌細(xì)胞特異表達(dá)Cre重組酶轉(zhuǎn)基因小鼠的建立［J］。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2005，29（3）：219-222。

［30］Qi X，Yang G，Yang L，Lan Y，Weng T，Wang J，Wu Z，Xu J，Gao X and Yang X：Essential role of Smad4 in maintaining cardiomyocyte proliferation during murine embryonic heart development［J］.Dev Biol，2007，311（1）：136-146.

［31］王劍，張莉，毛春明，程萱，侯寧，呂婭歆，楊曉：心臟組織特異性表達(dá)Cre重組酶轉(zhuǎn)基因小鼠的建立［J］。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2005，29（1）：38-40。

［32］Wang J，Xu N，F(xiàn)eng X，Hou N，Zhang J，Cheng X，Zhang Y，and Yang X：Targeted disruption of Smad4 in cardiomyocytes results in cardiac hypertrophy and heart failure［J］.Circ Res，2005，97（8）：821-828.

［33］Zhao Z，Hou N，Sun Y，Teng Y，Yang X：Atp4b promoter directs the expression of Crerecombinase in gastric parietal cells of transgenic mice［J］.J Genet Genomics，2010，37（9）：647-652.

［34］毛春明，楊曉，程萱，呂婭歆，周江，黃翠芬：角質(zhì)細(xì)胞特異性表達(dá)Cre重組酶轉(zhuǎn)基因小鼠的建立［J］。遺傳學(xué)報(bào)，2003，30（5）：407-413。

［35］Yang L，Wang L，Yang X：Disruption of Smad4 in mouse epidermis leads to depletion of follicle stem cells［J］.Mol Biol Cell，2009，20（3）：882-890.［36］Teng Y，Sun AN，Pan XC，Yang G，Yang L，Wang M and Yang X：Synergistic function of Smad4 and PTEN in suppressing for estomach squamous cell carcinoma in the mouse［J］.Cancer Res，2006，66（14）：6972-6981.

［37］Yang L，Mao C，Teng Y，Li W，Zhang J，Cheng X，Li X，Deng H，Yang X：Targeted disruption of Smad4 in mouse epidermis results in failure of hair follicle cycling and formation of skin tumors［J］.Cancer Res，2005，65（19）：8671-8678.

［38］Zhou J，Cheng X，Lu Y，Huang C，Yang X：A transgenic mouse that targets the expression of Crerecombinase in pancreatic tissue［J］，Chinese Journal of Biotechnology，2002，18（3）：286-290.

［39］王友亮，程萱，崔芳，程競，呂婭歆，楊曉：肝細(xì)胞組織特異性表達(dá)Cre重組酶轉(zhuǎn)基因小鼠的建立［J］。中華肝臟病雜志，2004，12（3）：163-166。

［40］程萱，翁土軍，譚曉紅，侯寧，王健，林福玉，黃培堂，楊曉：成骨細(xì)胞特異性表達(dá)Cre重組酶轉(zhuǎn)基因小鼠的建立［J］。遺傳，2007，29（10）：1237-1242。

［41］Weng T，Mao F，Wang Y，Sun Q，Li R，Yang G，Zhang X，Luo J，F(xiàn)eng G，Yang X：Osteoblasticmolecular scaffold Gab1 is required for maintaining bone homeostasis［J］.J Cell Sci，2010，123（5）：682-689.

［42］Gao Y，Yang G，Weng T，Du J，Wang X，Zhou J，Wang S，Yang X：Disruption of Smad4 in odontoblasts causes multiple keratocystic odontogenic tumors and tooth malformation in mice［J］.Mol Cell Biol，2009，29（21）：5941-5951.

［43］Tan X，Weng T，Zhang J，Wang J，Li W，Wan H，Lan Y，Cheng X，Hou N，Liu H，Ding J，Lin F，Yang R，Gao X，Chen D，Yang X：Smad4 is required for maintaining normal murine postnatal bone homeostasis［J］.J Cell Sci，2007，120（Pt 13）：2162-2170.

［44］Zha L，Hou N，Wang J，Yang G，Gao Y，Chen L，Yang X：Collagen1alpha1 promoter drives the expression of Cre recombinase in osteoblasts of transgenic mice［J］.J Genet Genomics，2008，35（9）：525-530.

［45］郝振明，楊曉，程萱，周江，黃翠芬：軟骨組織特異性表達(dá)Cre重組酶轉(zhuǎn)基因小鼠的研制和鑒定［J］。遺傳學(xué)報(bào)，2002，29（5）：424-429。

［46］Yang G，Sun Q，Teng Y，Li F，Weng T，Yang X：PTEN deficiency causes dyschondroplasia in mice by enhanced hypoxiainducible factor 1alpha signaling and endoplasmic reticulum stress［J］.Development，2008，135（21）：3587-3597.

［47］Zhang J，Tan X，Li W，Wang Y，Wang J，Cheng X and Yang X：Smad4 is required for the normal organization of the cartilage growth plate［J］.Dev Biol，2005，284（2）：311-322.

［48］Sun Q，Zhang Y，Yang G，Chen X，Zhang Y，Cao G，Wang J，Sun Y，Zhang P，F(xiàn)an M，Shao N and Yang X：Transforming growth factor-β regulated miR-24 promotesskeletalmuscle differentiation［J］，Nucleic Acids Research，2008，36（8）：2690-2699.

［49］Wang J，Song Y，Zhang Y，Xiao H，Sun Q，Hou N，Guo S，Wang Y，F(xiàn)an K，Zhan D，Zha L，Cao Y，Li Z，Cheng X，Zhang Y and Yang X：Cardiomyocyte overexpression of miR-27b induces cardiac hypertrophy and dysfunction in mice［J］，Cell Research，2011，epub ahead of print.