白 冰，趙 勇，張 海，師長宏

（第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，西安 710032）

將外源基因?qū)雱游矬w內(nèi)并獲得高效表達(dá)，是分子生物學(xué)、基因功能和調(diào)節(jié)、蛋白結(jié)構(gòu)和功能、基因治療以及生物工程等研究領(lǐng)域前進(jìn)發(fā)展至關(guān)重要的能力。這種能力甚至比人類基因組和基因克隆工程更重要。所以，迫切需要發(fā)明一種能使外源基因在活體內(nèi)高效表達(dá)，以便研究基因功能，為疾病的治療學(xué)研究打下基礎(chǔ)。水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)作為一種簡便、快速、高效的轉(zhuǎn)染方法得到了廣泛的應(yīng)用。

1 水動力轉(zhuǎn)染方法的概述

Wolff等［1］將裸質(zhì)粒DNA肌肉注射在小鼠體內(nèi)，首次發(fā)現(xiàn)在注射部位有目的基因的表達(dá)，根據(jù)Wolff最初的發(fā)現(xiàn)，許多實驗室進(jìn)行了多次類似的相關(guān)研究。證實了利用局部給藥的方法將外源基因注射在小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)在動物肝臟［2-4］、肺臟［5］、心臟［6］和皮膚［7］等部位都表達(dá)了目的基因。雖然，應(yīng)用裸質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染不需要相應(yīng)的病毒載體，省去了載體的制作過程，宿主也不會受病毒載體免疫遺傳學(xué)和致瘤因素的影響，更不會有內(nèi)源性病毒重組的危害［8］，但由于轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平很低，在治療學(xué)應(yīng)用上還有許多關(guān)鍵問題不能解決。直到1999年，Zhang等［9，10］從小鼠的尾靜脈快速注射了大體積（約2～3mL）含裸質(zhì)粒DNA的生理鹽水后，在肝臟細(xì)胞中直接檢測到了轉(zhuǎn)染的基因高水平且長時間的表達(dá)。才將該方法正式命名為水動力轉(zhuǎn)染法（hydrodynamics-based transfection）。

水動力轉(zhuǎn)染方法是指通過一種全身給藥的方法，即從小鼠的尾靜脈快速注射大體積（8～12mL/100g體重）含目的基因質(zhì)粒DNA的生理鹽水，從而達(dá)到外源基因在小鼠體內(nèi)高效表達(dá)?？傊?，這種方法與傳統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)染方法相比，是一種簡單、方便、高效的方法，可以在整個動物體內(nèi)表達(dá)外源基因。然而此技術(shù)在人類基因治療研究中的實用價值，一直未有相關(guān)文獻(xiàn)報道。從此，越來越多的研究者開始驗證此方法的可行性，并將其作為一種新的外源基因轉(zhuǎn)染方法，廣泛應(yīng)用于包括目的基因治療學(xué)活性在內(nèi)等各方面的評估［11］，DNA序列調(diào)節(jié)功能的分析［12］，以及用于消除靶基因表達(dá)的RNA干擾（RNAi）的設(shè)計等許多方面［13］。試驗結(jié)果證明，水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)確實是現(xiàn)代分子生物學(xué)領(lǐng)域不可或缺的一種新的基因研究手段。

2 水動力轉(zhuǎn)染法在肝炎病毒實驗動物模型研究中的應(yīng)用進(jìn)展

水動力轉(zhuǎn)染方法具有很好的肝臟靶向性，所以比較適用于肝炎病毒實驗動物模型及其相關(guān)的功能研究。肝炎病毒分為甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和丁型肝炎病毒四種，目前國際上利用水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)已經(jīng)成功建立了乙、丙、丁型肝炎病毒的實驗動物模型。

靈長類是乙型肝炎病毒易感種群，而其他種屬的動物都不易感染HBV。所以，為了突破這種種屬的障礙，2003年，Suzuki等［14］將相當(dāng)于HBV基因組1.5倍長的核酸經(jīng)水動力轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入具有免疫活性的小鼠體內(nèi)，在肝臟中檢測到了乙肝病毒的轉(zhuǎn)錄，HBV核心蛋白在約3％的肝細(xì)胞中表達(dá)。2005年，吳瑩等［15］利用水動力轉(zhuǎn)染方法，將1.3倍的HBV真核表達(dá)質(zhì)粒（pHBV1.3）轉(zhuǎn)染入小鼠體內(nèi)。同時，將HBV全基因組質(zhì)粒與HBV核心區(qū)的siRNA表達(dá)載體（pSI-C）一起注射入小鼠體內(nèi)，做了RNA干擾治療小鼠急性乙型肝炎病毒的實驗，發(fā)現(xiàn)pSI-C干擾組HBsAg和HBsAg的表達(dá)均受到抑制，血清中HBsAg陰性，表明RNAi技術(shù)能特異、高效地抑制小鼠體內(nèi)HBV的復(fù)制和表達(dá)，提示siRNA作為一種新型的抗病毒藥物的巨大潛能。HBV實驗動物模型的成功建立，為今后進(jìn)行藥物篩選及抗病毒治療的研究拓展了新的思路。

有研究［16］表明：HCV RNA N端具有的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點（IRES）是反義核酸、核酶和siRNA等藥物治療的重要靶位。但是，缺乏合適的HCV感染細(xì)胞及小動物模型是目前抗HCV藥物研究和開發(fā)的主要障礙之一。2002年，McCaffrey等［17］利用水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)將螢火蟲熒光素酶基因和HCV IRES的融合基因從小鼠尾靜脈注射入體內(nèi)，觀察到小鼠體內(nèi)HCV IRES螢火蟲熒光素酶報道m(xù)RNA翻譯的實時圖像，表明HCV IRES在小鼠體內(nèi)是有功能的，從而建立了能用于篩選HCV IRES抑制藥物的小鼠丙肝模型。

3 水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)在其他肝臟疾病研究中的應(yīng)用

肝臟纖維化是一個嚴(yán)重威脅人類健康的問題，目前還沒有任何有效的藥物來治療此病，防止纖維形成和復(fù)蘇內(nèi)源性修復(fù)活性是目前乃至以后治療的一個重要策略。許多肝纖維化研究的動物試驗都是用各種肝毒素感染的，但是這種方法感染的動物模型形成的肝硬化或廣泛的不可逆的纖維變性比較普遍，而且不是典型的早期肝纖維化。在纖維化疾病的發(fā)展和發(fā)病機制的研究中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）是一個25×103的多功能細(xì)胞因子，已經(jīng)被證實起重要作用［18］。Yang等［19］利用水動力轉(zhuǎn)染法將轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）基因的裸質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)。盡管TGF-β1的誘導(dǎo)作用是暫時的，但是纖維化水平?jīng)]有達(dá)到較大的范圍，所以此模型是一個動態(tài)的可逆的肝纖維化實驗動物模型，對纖維化早期分子機制及抗纖維化藥物的研究有重要意義。

4 水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)在糖尿病研究中的應(yīng)用

He等［20］將胰島素的cDNA插入在質(zhì)粒載體的CMV啟動子下游，通過水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)將獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入用STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠體內(nèi)，經(jīng)過檢測葡萄糖的水平、小鼠的體重、胰島素水平、肝臟的免疫組織學(xué)和肝臟中胰島素mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染之后，糖尿病小鼠血漿中的胰島素顯著增加，通過免疫染色證明肝臟中的胰島素陽性，同時血糖過多的并發(fā)癥也得到改善，小鼠血中的葡萄糖降至正常水平，體重下降的癥狀也得到改善。而且快速的尾靜脈注射沒有引起任何致命損害。利用水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)，使得胰島素基因在肝臟中得到高水平的表達(dá)，從而控制I型糖尿病的血糖并改善其癥狀。此方法為研究1型糖尿病基因療法提供了一種簡單而有效的途徑。

5 水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)在心肌炎研究中的應(yīng)用

白細(xì)胞介素-1（IL-1）是心肌炎中一個作用很重要的細(xì)胞因子，為了研究IL-1受體拮抗劑（IL-1RA）免疫球蛋白（Ig）基因在治療試驗性自身免疫心肌炎（EAM）中的作用及其機理，Liu等［21］將分別編碼IL-1RA-Ig和Ig的載體質(zhì)粒通過水動力轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入大鼠體內(nèi)。在轉(zhuǎn)染的第17天，通過超聲心動圖和血液動力學(xué)參數(shù)顯示心臟功能改善，心房中促尿鈉排泄的基因表達(dá)減少，及心肌炎的面積減少等各方面指標(biāo)表明IL-1RA-Ig基因療法在控制EAM中效果明顯。由此說明，利用水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)成功的建立了心肌炎實驗動物大鼠模型。

6 水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)在腎臟疾病研究中的應(yīng)用

基因療法是治療腎臟疾病的一場革命。而運用基因療法首先必須有成功的實驗動物模型，在動物模型的基礎(chǔ)上先評估基因療法的效果，療效明顯的方能用于臨床試驗。由于病毒的白介素-10（vIL-10）具有多種免疫調(diào)制的特性，因此Higuchi等［22］利用水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)將表達(dá)vIL-10的質(zhì)粒DNA導(dǎo)入已感染新月體腎小球腎炎的WK大鼠體內(nèi)。實驗結(jié)果中實驗組大鼠的新月體形成減少、腎小球中的總細(xì)胞數(shù)、巨噬細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞數(shù)量及尿蛋白相應(yīng)的減少，腎臟異常功能的弱化等，細(xì)胞因子檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染含有vIL-10質(zhì)粒的大鼠腎小球內(nèi)的INF-γ、TNF-α等因子水平明顯低于對照組。此研究表明應(yīng)用水動力轉(zhuǎn)染法的vIL-10基因療法對治療新月體腎小球腎炎效果非常顯著，為進(jìn)一步研究基因療法和開發(fā)基因藥物奠定了基礎(chǔ)。

7 水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)在抗腫瘤研究中的應(yīng)用

將外源基因通過水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，并在小鼠肝臟獲得高水平的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，Tsuyama等［23］為了評估TNF-α在腫瘤治療中的效果，先用B16黑色素瘤細(xì)胞感染小鼠，再利用水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)將編碼TNF-α的裸質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染入小鼠體內(nèi)。TNF-α表達(dá)的量隨轉(zhuǎn)染質(zhì)粒中TNF-α含量的增加而增高，而TNF-α的活性在轉(zhuǎn)染后9h達(dá)到峰值，之后又逐漸下降。TNF-α是一種促炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子，當(dāng)其劑量達(dá)到高峰時對治療效果起到關(guān)鍵性作用。此研究也顯示了水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)有操作簡單、轉(zhuǎn)染效果明顯的優(yōu)勢，在癌癥的基因治療研究中顯示了不可替代的優(yōu)越性。

在各種免疫治療途徑中，白細(xì)胞介素12（IL-12）因其占有優(yōu)勢的抗腫瘤作用而備受矚目。但是由于INF-γ的超常誘導(dǎo)，使得IL-12治療具有嚴(yán)重的副作用。為了優(yōu)化其治療效果并降低副作用，Wang等［24］通過水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)，將IL-12和粒性白細(xì)胞-巨噬細(xì)胞菌落刺激因子（GM-CSF）的結(jié)合基因轉(zhuǎn)染入小鼠體內(nèi)，顯示IL-12和GM-CSF誘導(dǎo)了很強的抗癌抗菌素細(xì)胞免疫力，獲得了對鼠科動物肝細(xì)胞癌的顯著治療效果。

8 水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)應(yīng)用的前景

水動力轉(zhuǎn)染方法為研究者在整個動物體內(nèi)進(jìn)行基因表達(dá)的調(diào)控、基因表達(dá)產(chǎn)物功能的分析提供了一個便利的工具，尤其是越來越多地應(yīng)用于許多種遺傳性和后天獲得性疾病的分子機制方面的研究。另外，這種方法可以為建立很好的細(xì)菌蛋白表達(dá)系統(tǒng)提供幫助；從人類基因組中新發(fā)現(xiàn)了越來越多的基因，需要對這些基因的功能進(jìn)行研究，而水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)也對此非常有用［25］。

總之，水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)作為一種比較成功的、簡單、快捷、高效的轉(zhuǎn)染方法，會被越來越多地應(yīng)用于科學(xué)研究。

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