許黎黎，張連峰

（中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，北京 100021）

埃博拉出血熱（Ebola hemorrhagic fever，EHF）是由埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）引起的一種急性出血性傳染病，自1976年在非洲中部扎伊爾（現(xiàn)剛果民主共和國）和蘇丹暴發(fā)流行后，已在非洲中部形成地方流行，主要包括烏干達、剛果、加蓬、蘇丹、科特迪瓦、利比里亞、南非等國家于20世紀70年代在非洲首次發(fā)現(xiàn)［1-3］，具有極高的傳染性，致死率高達50％～88％。人主要通過接觸病人或感染動物的體液、排泄物、分泌物等而感染。臨床表現(xiàn)主要為發(fā)熱、出血和多臟器損害。

作為18種可引起人類病毒性出血熱綜合征的病毒之一，EBOV包括四種亞型：埃博拉-扎伊爾（Ebola-Zaire，ZEBOV），埃博拉-蘇丹（Ebola-Sudan，SEBOV），埃博拉-科特迪瓦（Ebola-Cote d’Ivoire，CEBOV）和埃博拉-萊斯頓（Ebola-Reston，REBOV）。發(fā)生在扎伊爾、蘇丹和科特迪瓦的三種亞型EBOV已被證實能夠使人類致病。不同亞型毒力不同，ZEBOV毒力最強，人感染死亡率高達88％；SEBOV次之，致死率約為50％；CEBOV對黑猩猩有致死性，對人的毒力較弱，致病但不致死；REBOV對非人靈長類有致死性，人感染不發(fā)?。?］。

由于其在自然界的宿主尚未查明，且暫無有效的抗病毒藥物和疫苗，目前對埃博拉出血熱的預防還極為困難。世界衛(wèi)生組織已將EBOV列為對人類危害最嚴重的第4級病毒，相關(guān)的實驗操作要求必須在高度安全的BSL-4級實驗室中進行。

1 埃博拉出血熱的流行病學

1.1 自然宿主

EBOV的自然宿主至今尚未確定。研究表明蝙蝠可能是EBOV的潛在自然宿主之一［5］。法國研究人員于2001至2003年間在爆發(fā)過埃博拉出血熱疫情的加蓬和剛果兩國捕捉了上千只不同的動物，其中包括679只不同種類的蝙蝠，222只鳥類和129只松鼠等小哺乳動物。通過檢測，研究人員在3種近29只蝙蝠的體內(nèi)（包括血液、肝臟和脾臟中）發(fā)現(xiàn)了感染過EBOV的痕跡，但這些蝙蝠卻都沒有出現(xiàn)埃博拉出血熱的癥狀，他們推測蝙蝠具有成為EBOV自然宿主的條件［6，7］。目前認為EBOV的宿主也可能為某些嚙齒類動物或鳥類。從中非共和國的2種嚙齒類動物的器官中檢測到了與ZEBOV型的GP和L相同的序列，說明EBOV與非洲動物種群可能有著共同的進化歷史。另一方面，EBOV入侵的生化途徑及病毒的蛋白質(zhì)外殼與多種鳥類的反轉(zhuǎn)錄病毒非常相似，這提示鳥類可能是EBOV的天然宿主，或鳥類反轉(zhuǎn)錄病毒與EBOV有著相同的祖先，但鳥類是否傳染EBOV還未能確定［8］。

1.2 傳播途徑

接觸傳播是本病最主要的傳播途徑。病人或動物的血液及其他體液，嘔吐物，分泌物，排泄物（如尿、糞便）等均具有高度的傳染性，可以通過接觸病人和亞臨床感染者（特別是血液，排泄物及其它污染物）而感染。病人自急性期至死亡前血液中均可維持很高的病毒含量，醫(yī)護人員在治療，護理病人時，或處理病人尸體過程中容易受到感染，病人的轉(zhuǎn)診還可造成醫(yī)院之間的傳播。醫(yī)院內(nèi)傳播是導致埃博拉出血熱暴發(fā)流行的重要因素。

吸入感染性的分泌物，排泄物等也可造成感染。l995年曾有學者報道用恒河猴，獼猴作為感染EBOV實驗動物，含有感染動物分泌物，排泄物的飛沫通過空氣傳染了正常猴，證實了氣溶膠在EBOV傳播中的作用。

以往，使用未經(jīng)消毒的注射器是該病的重要傳播途徑。1976年扎伊爾一位疑診為瘧疾的病人，在接受注射治療后1周內(nèi)，數(shù)位在該院住院接受注射治療的病人感染了埃博拉出血熱而死亡。另外，在一埃博拉出血熱病人發(fā)病后第39天和第61天，甚至第101天的精液中均檢測到EBOV，故存在性傳播的可能性。

2 埃博拉病毒的基因組結(jié)構(gòu)

EBOV屬絲狀病毒屬（FilovirusFamily），其形態(tài)包括桿狀，絲狀，及“L”形，毒粒長度平均l000nm，直徑70～90nm。EBOV基因組是不分節(jié)段的負鏈RNA，長度為18.9kb，含7個開放閱讀框［9，10］，在病毒基因組中的基因排列順序為：3’-NP-VP35-VP40-GP/sGP-VP30-VP24-L-5’，每種產(chǎn)物均由各自單獨的mRNA所編碼。包膜糖蛋白GP為I型跨膜蛋白，具有2個閱讀框，分別編碼1個分泌型的小蛋白sGP（secreted GP）和1個全長的跨膜GP，sGP作為GP的早期產(chǎn)物被大量分泌出來，可能與干擾免疫細胞對病毒的殺傷作用有關(guān)，然后再通過RNA編輯或框架漂移方式合成GP蛋白。GP是病毒表面棘突的唯一結(jié)構(gòu)蛋白，它通過與受體結(jié)合介導病毒進入宿主細胞；GP可通過與內(nèi)皮細胞結(jié)合破壞微血管的完整性，引起血管滲漏［11］。VP40是與毒粒內(nèi)膜相關(guān)的基質(zhì)蛋白，在病毒以病毒樣顆粒（virus-like particles，VLPs）方式在宿主細胞芽生過程中起重要作用。VP24為小型膜蛋白，可能與病毒的組裝和出芽釋放有關(guān)［12］。研究表明，正是這三種與膜相偶聯(lián)的蛋白（GP，VP40和VP24），在病毒的毒粒裝配、出芽以及致病過程中起到了相當關(guān)鍵的作用［13，14］。NP為病毒的核衣殼蛋白；VP35不僅在RNA的合成中起到不可替代的作用，而且還可以抑制I型干擾素；VP30是一種鋅指結(jié)構(gòu)蛋白，能與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)結(jié)合，可激活病毒的轉(zhuǎn)錄；病毒多聚酶L（polymerase）是一種依賴于RNA的RNA聚合酶。

3 埃博拉出血熱的發(fā)病機制、病理改變及臨床表現(xiàn)

病毒進入機體后，可能在局部淋巴結(jié)首先感染單核吞噬系統(tǒng)的細胞（mononuc1ear phagocytic system，MPS），包括單核細胞和巨噬細胞等等。一些感染的MPS細胞轉(zhuǎn)移到其他組織，當病毒釋放到淋巴或血液中，可以引起肝臟、脾臟以及全身固定的或移動的巨噬細胞感染。從MPS細胞釋放的病毒可以感染相鄰的細胞，包括肝細胞、腎上腺上皮細胞和成纖維細胞等。感染的MPS細胞同時被激活，釋放大量的細胞因子和趨化因子。這些細胞活性物質(zhì)可增加血管內(nèi)皮細胞的通透性，誘導表達內(nèi)皮細胞表面粘附和促凝因子，以及組織破壞后血管壁膠原暴露，釋放組織因子等，最終導致彌散性血管內(nèi)凝血（DIC）。埃博拉出血熱的一個顯著特點是抑制宿主的免疫反應，在感染晚期可發(fā)生脾臟、胸腺和淋巴結(jié)等大量淋巴細胞凋亡［5，14-16］，患者經(jīng)常還沒有出現(xiàn)有效的免疫反應就已經(jīng)死亡，甚至在幸存者的恢復期也檢測不到病毒的中和抗體［14］。

感染后主要的病理改變是皮膚，黏膜，臟器的出血，在很多器官可以見到灶性壞死，但是以肝臟、淋巴組織最為嚴重。肝細胞點，灶樣壞死是本病最顯著的特點，可見小包涵體和凋亡小體。

病人感染后潛伏期為2～2ld，一般為5～12d。感染EBOV后可不發(fā)病或呈輕型，非重病病人發(fā)病后2周逐漸恢復。起病急，臨床表現(xiàn)為高熱、畏寒、頭痛、肌痛、惡心、結(jié)膜充血及相對緩脈。2～3d后可有嘔吐、腹痛、腹瀉、血便等表現(xiàn)，半數(shù)病人有咽痛及咳嗽。病后4～5d進入極期，病人可出現(xiàn)神志的改變，如譫妄、嗜睡等，重癥病人在發(fā)病數(shù)日可出現(xiàn)咯血，鼻、口腔、結(jié)膜下、胃腸道、陰道及皮膚出血或血尿，第10天為出血高峰，50％以上的病人出現(xiàn)嚴重的出血，并可因出血、肝腎功能衰竭及致死性并發(fā)癥而死亡。90％的死亡病人在發(fā)病后12d內(nèi)死亡（7～14d）。病人最顯著的表現(xiàn)為低血壓、休克和面部水腫，還可出現(xiàn)DIC，電解質(zhì)和酸堿的平衡失調(diào)等。急性期并發(fā)癥有心肌炎、細菌性肺炎等。由于病毒持續(xù)存在于精液中，也可引起睪丸炎、睪丸萎縮等遲發(fā)癥。在病程第5天至第7天可出現(xiàn)麻疹樣皮疹，以肩部、手心和腳掌多見，數(shù)天后消退并脫屑，部分病人可較長期地留有皮膚的改變［5，15，16］。

4 埃博拉出血熱引發(fā)機體的免疫反應

4.1 先天免疫損傷

許多研究表明先天免疫反應在EBOV感染中起核心作用，人類和非人靈長類感染后可檢測到伴隨大量細胞因子產(chǎn)生的炎癥反應。在人體內(nèi)，EBOV選擇性抑制IFN-α和IFN-γ的相關(guān)功能，Basler等［17］鑒別出了可以干擾IFN反應的兩種EBOV蛋白，其中VP24可能阻礙IFN信號轉(zhuǎn)導，VP35阻礙IRF3的磷酸化，而IRF3在IFN產(chǎn)生中起轉(zhuǎn)錄因子的作用。單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞（DCs）在EBOV感染中是最重要的早期靶細胞，但機體感染EBOV后，單核細胞和巨噬細胞的作用有多大，還未被廣泛研究。相反，在先天免疫和獲得性免疫中都有重要作用的DCs，在體外感染EBOV實驗研究中發(fā)現(xiàn)其并不行使功能，即不能產(chǎn)生前炎性細胞活素或表達協(xié)同刺激分子。自然殺傷細胞NK也是受EBOV感染影響的先天免疫細胞，這些細胞以獨立抗原的方式應答病毒的感染，并通過釋放穿孔素和顆粒酶誘導凋亡來殺死被感染的細胞。非人類靈長感染EBOV的過程中，NK細胞的數(shù)量銳減，第4天后幾乎完全消失，而另有研究表明，人類感染EBOV后體內(nèi)NK細胞的數(shù)量僅略為減少。

4.2 獲得性免疫損傷

從人類感染EBOV獲得的有效數(shù)據(jù)中得出，獲得性免疫在致死和非致死病例中呈顯著不同，這暗示了獲得性免疫在EBOV感染中的重要作用。對幸存者的研究顯示，機體被攻擊2d后就產(chǎn)生特異性IgM抗體，在5～8d后產(chǎn)生特異性IgG抗體。相反，在致死病例中，只有30％的病人被檢測出了低水平的特異性IgM，而特異性IgG未被檢測到。在癥狀發(fā)生后的初期出現(xiàn)的獲得性免疫應答對患者能否存活有重要影響，幸存者在感染EBOV后出現(xiàn)的早期炎癥反應也使這個假設得到了支持。

5 埃博拉出血熱的研究模型

EBOV可在人、猴、豚鼠等哺乳類動物細胞中增殖，其中Vero-98，Vero-E6，He1a-229細胞最敏感。病毒接種后，6～7d后出現(xiàn)細胞病變，表現(xiàn)為細胞圓化，皺縮，細胞質(zhì)內(nèi)可見纖維狀或顆粒狀結(jié)構(gòu)的包涵體［16］。

目前常用的EBOV動物模型主要包括小鼠、豚鼠、及非人靈長類三種。免疫系統(tǒng)完整的成熟小鼠并不能感染EBOV，推測可能是由于其強大的先天免疫系統(tǒng)，尤其是IFN-Ⅰ型反應所導致［18］。然而，腹腔或腦內(nèi)接種病毒可導致乳鼠［19］、成熟的免疫系統(tǒng)缺陷SCID小鼠［20］、以及IFN α/β受體或STAT基因敲除小鼠［21，22］的死亡。另一途徑是通過將ZEBOV在免疫系統(tǒng)完整的小鼠體內(nèi)連續(xù)傳代，來獲得小鼠適應株［23］。

用EBOV攻毒豚鼠僅能引發(fā)短時的，非致死的發(fā)熱癥狀［24］。同樣，使用ZEBOV在近交及遠交系豚鼠體內(nèi)連續(xù)傳代可獲得使豚鼠致死的適應株［24］。

很多非人靈長類動物均被用于EBOV動物模型的研究。其中狒狒對所有亞型EBOV均存在一定程度耐受，非洲綠猴（Chlorocebus aethiops）對REBOV毒株耐受［24］。恒河猴（Rhesus macaques）和食蟹猴（Cynomolgus macaques）是目前使用的最為廣泛的埃博拉動物模型，均對EBOV高度敏感，可引起與人類極為類似的臨床癥狀。食蟹猴對ZEBOV毒株最敏感，臨床癥狀出現(xiàn)最快；而恒河猴臨床癥狀出現(xiàn)時間要稍慢一些，但更接近于人類。對模型更詳細的說明見我們的另外一篇綜述［25］。

6 埃博拉出血熱的疫苗研究

埃博拉出血熱的防治方法主要有以下3種：①密切注意世界EBOV疫情動態(tài)，加強國境檢疫；②病人處理，發(fā)現(xiàn)病人后嚴格隔離治療，病人的分泌物和排泄物要嚴格消毒，病人用過的衣物進行蒸汽消毒，病人的尸體應包裹嚴密就近火葬或掩埋，需轉(zhuǎn)移處理時，應放在密閉容器中進行，醫(yī)務人員做好自身防護工作，如接觸病人時需戴口罩、手套、眼鏡、帽子和防護服，嚴密防止接觸病人污染物；③免疫預防。疫苗作為最有效的防治方法，一直是科研工作者努力的方向。

6.1 活載體疫苗

應用無致病性或弱毒的病毒和細菌，例如痘病毒、雞痘病毒、火雞皰疹病毒、偽狂犬病毒、腺病毒以及卡介苗分枝桿菌和沙門氏菌弱毒疫苗等作為載體，插入外源性保護基因，構(gòu)建重組活載體疫苗。用活病毒為載體表達EBOV蛋白有一個優(yōu)點，即病毒疫苗進入人體后接近于自然感染，EBOV蛋白便可在轉(zhuǎn)染的細胞中表達。這種方法有兩個缺點：一是宿主細胞中大量的載體蛋白會導致免疫競爭，由此削弱了由載體表達的特異性EBOV蛋白的免疫反應。二是人體中原先存在的免疫力可能會在機體針對活載體疫苗產(chǎn)生足夠免疫應答之前就清除了被轉(zhuǎn)染的細胞［26］。

6.2 DNA疫苗

將經(jīng)篩選的EBOV基因克隆到質(zhì)粒載體中，通過肌肉注射的方式注入重組DNA，或者將重組DNA涂在膠體金顆粒表面，然后用基因槍注入皮膚內(nèi)，同時結(jié)合委內(nèi)瑞拉復制子，使這一體系具有體液免疫和細胞免疫都能同時誘導EBOV蛋白產(chǎn)生的優(yōu)點。與上述活載體疫苗方法不同的是，DNA疫苗不會誘發(fā)針對載體自身免疫反應。但是，這種方法需要很高的注射劑量，而且克隆DNA很可能會整合到宿主基因組內(nèi)，這也是一個值得高度關(guān)注的安全性問題［27］。

6.3 用DNA激發(fā)配合腺病毒（AdV）增強疫苗（DNA/AdV法）

此種疫苗是美國NIH疫苗研究中心的研究人員Gary Nabel等于2000年研制開發(fā)的，是繼DNA疫苗之后的又一新型疫苗，目前已進入二期臨床階段。主要采取“兩步走”的策略，首先向動物體內(nèi)注射DNA疫苗，隨后用腺病毒載體疫苗加強免疫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小白鼠抗體效價的增長較單用DNA疫苗有10～100倍的增長。然后在恒河猴中進行進一步試驗，結(jié)果顯示接種安慰劑的4只猴子在2周內(nèi)死亡。而接種疫苗的4只猴子均存活。然而，該疫苗接種過程長達6個月，需進行4次注射，無法有效控制快速傳播的疾?。?6，28］。

6.4 快速疫苗

2003年8月，一種針對EBOV的快速疫苗被研制出來，此疫苗僅需通過一次注射，4周后就能使短尾猿免受EBOV的感染?？焖僖呙缡怯孟俨《荆ˋdV）為載體來表達EBOV的GP基因，它比用DNA激發(fā)，AdV刺激的反應的速度要快得多，但此反應相對較弱［26，28］。

7 埃博拉出血熱對我國的潛在威脅

目前，我國尚未發(fā)現(xiàn)感染埃博拉出血熱病例，但隨著我國與世界其他國家之間的貿(mào)易、旅游、人員往來日益頻繁，EBOV通過各種途徑傳入我國是有可能的。EBOV是一種新生的病原微生物，我國人群無免疫力，普遍易感。如前所述，從病毒活載體疫苗、DNA疫苗、用DNA激發(fā)配合腺病毒增強疫苗到快速疫苗，人類在征服EBOV的這條道路上已經(jīng)邁進了一大步，同時也給予我們征服其它高危烈性病毒性疾病有很大的啟迪?？傊?，對EBOV的深入研究，將對今后防治埃博拉出血熱提供科學依據(jù)，為更快、更早地研制有效的治療藥物及疫苗奠定基礎。

［1］Pourrut X，Kumulungui B，Wittmann T，et al.The natural history of Ebola virus in Africa［J］.Microbes Infect，2005，7：1005-1014.

［2］Colebunders R，Borchert M.Ebola haemorrhagic fever--a review［J］.J Infect，2000，40：16-20.

［3］Peters CJ，LeDuc JW.An introduction to Ebola：the virus and the disease［J］.J Infect Dis，1999，179 Suppl 1：ix-xvi.

［4］Bente D，Gren J，Strong JE，et al.Disease modeling for Ebola and Marburg viruses［J］.Dis Model Mech，2009，2：12-17.

［5］Groseth A，F(xiàn)eldmann H，Strong JE.The ecology of Ebola virus［J］.Trends Microbiol，2007，15：408-416.

［6］Biek R，Walsh PD，Leroy EM，et al.Recent common ancestry of Ebola Zaire virus found in a bat reservoir［J］.PLoS Pathog，2006，2：e90.

［7］Pourrut X，Souris M，Towner JS，et al.Large serological survey showing cocirculation of Ebola and Marburg viruses in Gabonese bat populations，and a high seroprevalence of both viruses in Rousettus aegyptiacus［J］.BMC Infect Dis，2009，9：159.

［8］Gallaher WR.Similar structural models of the transmembrane proteins of Ebola and avian sarcoma viruses［J］.Cell，1996，85：477-478.

［9］Volchkova VA，F(xiàn)eldmann H，Klenk HD，etal.The nonstructural small glycoprotein sGP of Ebola virus is secreted as an antiparallel-orientated homodimer［J］.Virology，1998，250：408-414.

［10］Sanchez A，Rollin PE.Complete genome sequence of an Ebola virus（Sudan species）responsible for a 2000 outbreak of human disease in Uganda［J］.Virus Res，2005，113：16-25.

［11］Yang Z，Delgado R，Xu L，et al.Distinct cellular interactions of secreted and transmembrane Ebola virus glycoproteins［J］.Science，1998，279：1034-1037.

［12］Han Z，Boshra H，Sunyer JO，et al.Biochemical and functional characterization of the Ebola virus VP24 protein：implications for a role in virus assembly and budding［J］.J Virol，2003，77：1793-1800.

［13］Beer B，Kurth R，Bukreyev A.Characteristics of Filoviridae：Marburg and Ebola viruses［J］.Naturwissenschaften，1999，86：8-17.

［14］Sullivan N，Yang ZY，Nabel GJ.Ebola virus pathogenesis：implications for vaccines and therapies［J］.J Virol，2003，77：9733-9737.

［15］Feldmann H，Wahl-Jensen V，Jones SM，et al.Ebola virus ecology：a continuing mystery［J］.Trends Microbiol，2004，12：433-437.

［16］Zaki SR，Goldsmith CS.Pathologic features of filovirus infections in humans［J］.Curr Top Microbiol Immunol，1999，235：97-116.

［17］Basler CF，Wang X，Muhlberger E，et al.The Ebola virus VP35 protein functions as a type I IFN antagonist［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2000，97：12289-12294.

［18］Bray M.The role of the Type I interferon response in the resistance of mice to filovirus infection［J］.J Gen Virol，2001，82：1365-1373.

［19］van der Groen G，Jacob W，Pattyn SR.Ebola virus virulence for newborn mice［J］.J Med Virol，1979，4：239-240.

［20］Warfield KL，Alves DA，Bradfute SB，et al.Development of a model for marburgvirus based on severe-combined immunodeficiency mice［J］.Virol J，2007，4：108.

［21］Bray M，HatfillS，Hensley L，et al.Haematological，biochemical and coagulation changes in mice，guinea-pigs and monkeys infected with a mouse-adapted variant of Ebola Zaire virus［J］.J Comp Pathol，2001，125：243-253.

［22］Gibb TR，BrayM，GeisbertTW，etal.Pathogenesisof experimental Ebola Zaire virus infection in BALB/c mice［J］.J Comp Pathol，2001，125：233-242.

［23］Bray M，Davis K，Geisbert T，et al.A mouse model for evaluation of prophylaxis and therapy of Ebola hemorrhagic fever［J］.J Infect Dis，1998，178：651-661.

［24］Ryabchikova E，Kolesnikova L，Smolina M，et al.Ebola virus infection in guinea pigs：presumable role of granulomatous inflammation in pathogenesis［J］.Arch Virol，1996，141：909-921.

［25］許黎黎，秦川.埃博拉出血熱動物模型研究進展［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2010，20（9），67-71.

［26］Wilson JA，Bosio CM，Hart MK.Ebola virus：the search for vaccines and treatments［J］.Cell Mol Life Sci，2001，58：1826-1841.

［27］Volchkov VE，Volchkova VA，Muhlberger E，et al.Recovery of infectious Ebola virus from complementary DNA：RNA editing of the GP gene and viral cytotoxicity［J］.Science，2001，291：1965-1969.

［28］Hart MK.Vaccine research efforts for filoviruses［J］.Int J Parasitol，2003，33：583-595.