魏 強，秦 川

（中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，北京 100021）

我國是人口大國，也是多種重大傳染病、感染性疾病多發(fā)國家之一。艾滋病、結核病、乙型肝炎、SARS、手足口病、禽流感和甲型H1N1流感等重大感染性疾病都使我國面臨重大挑戰(zhàn)。但對于治療，包括預防性和治療性疫苗免疫目前還受到很大的限制，主要集中在以下諸多方面，如病原生物學特性尚未完全清楚，致病的機制不十分清楚，藥物、疫苗篩選在很大程度上缺乏動物模型。對感染性疾病或病原性動物模型的認識，也一直存在不足，甚至不十分正確，因此，制備的動物模型不規(guī)范，針對性不強，甚至不是真正意義上的動物模型。

早期，確定病毒性病原作為某種疾病的病原，需滿足Koch定律6項要素，即能從患者中分離到病毒；能在某種宿主細胞中培養(yǎng)；病原具有濾過性；在同一宿主種類或相關動物種類中能復制疾病；在感染的動物中能再分離到病毒；并且能檢測到針對此病毒產生的特異性免疫反應［1］。這些要素也成為動物模型的重要參考指標，后兩條“在感染的動物中能再分離到病毒”和“并且能檢測到針對此病毒產生的特異性免疫反應”，是制備動物模型的關鍵。

感染性疾病特性之一是疾病因明確的病原引起，包括病毒、細菌和寄生蟲等生物體感染機體，導致疾病發(fā)生。因此，動物模型的研究，關鍵點是病原對動物的致病性問題，也就是說，動物能不能被病原感染，復制、模擬出全部或部分疾病特征的問題。一般來講，病原進化伴隨著宿主或寄生、相伴動物同時進化，因此，形成了相互依存、共處、排斥等關系，這種相互依存、共處、排斥關系，表現(xiàn)為共生關系、機體損傷（疾?。?、病原不能存活等情況。病原依據(jù)種類和生物學特性不同，分為體外寄生感染，器官、組織內感染（包括血液）和細胞內感染幾種形式，因此，感染的機制明顯不同，對感染動物宿主特異性選擇要求也不同，一般依寄生蟲、細菌和病毒的順序特異性增強，特別是病毒性病原，其感染往往通過特異性受體進入細胞，而受體的進化在不同動物體內變化程度有時并不隨動物種類近似而接近，因此，給動物模型的制備帶來了不確定性和復雜性，這也是目前有些病原沒有理想的動物模型的原因之一。但同時，由于各種動物遺傳構成和生物學特性既有相似的一面又有不同的一面，也使得遺傳距離大的動物作為感染病模型成為了可能［2，3］。因而，感染性動物模型研究，特別是新發(fā)感染性疾病病原，面臨的第一個問題是動物的感染性，或稱為動物敏感性的問題，往往通過大量不同種類動物的測試、篩選，才能研制出較為理想的模型［4，5］。關于感染性疾病模型制備，提出以下一些觀點。

1 感染性疾病動物模型制備的一般原則

感染性疾病動物模型，顧名思義，是以導致感染性疾病的病原感染動物，或人工導入病原遺傳物質，使動物發(fā)生和人類相同疾病、類似疾病、部分疾病改變或機體對病原產生反應，為疾病系統(tǒng)研究、比較醫(yī)學研究以及抗病原藥物和疫苗等研制、篩選和評價提供的模式動物。病原性動物模型包括三個要素：確切的病原、明確的動物和充分的實驗室指標。根據(jù)以上內容，除了動物模型制備的一般原則，提出制備、建立重點要求以下原則：

1.1 動物選擇原則

即從動物的種類、遺傳分類、生物學特性和對感染性疾病病原被感染程度（敏感性）等方面選擇動物。由于感染性疾病病原非常復雜，有些實驗動物感染性不強或不能被感染，或新發(fā)感染性疾病病原情況不明時，可供模型制備的動物可擴大到實驗用動物，包括實驗動物，經濟動物和野生動物。三類動物選擇的優(yōu)缺點分別為：實驗動物遺傳背景和微生物、寄生蟲等級標準清楚，環(huán)境條件可以完全控制，影響因素少，結果準確，標準化程度高為優(yōu)點，缺點是，因為實驗動物，尤其是嚙齒類動物廣為遺傳改良動物，和人遺傳狀態(tài)不同，環(huán)境條件完全不同，病原致病特性也會不同；經濟動物環(huán)境條件類似人類生活環(huán)境，疾病發(fā)生模式非常相近，但是影響因素多，標準化程度高不高；野生動物最接近自然，接觸的病原也最多，免疫系統(tǒng)較強，對實驗影響的不確定因素非常多，往往帶來生物安全等問題。所以，在病原敏感性相同或接近情況下，動物選擇的優(yōu)先順序應該是首選實驗動物、其次為經濟動物、野生動物。

1.2 病原選擇原則

即從感染性疾病病原標準株、代表株、強勢病原、活化狀態(tài)等方面選擇病原。由于病原是活性生命體，尤其病毒性病原體，非常容易失活，模型制備使用的病原應該處于活化狀態(tài)最好的病原。同時，導致相同感染性疾病的病原在不同地區(qū)存在差異，致病性也會不同，因此，應該選擇生物學特性明確的經鑒定的標準株進行模型感染研究，以確保得到的疾病模型保持最高真實性。

1.3 疾病再現(xiàn)最大化原則

即制備的感染性疾病動物模型能最大程度的擬似疾病臨床表現(xiàn)、疾病過程、病理生理學變化、免疫學反應等疾病特征。這種最大化原則可以是全部完整的擬似，也可以是部分體現(xiàn)。

1.4 標準化、規(guī)范化原則

即模型制備涉及的動物、病原、實驗控制、操作程序、標本處理、數(shù)據(jù)采集、檢測指標和結果分析應該到達統(tǒng)一、規(guī)范和標準化要求，可實現(xiàn)模型重復性好，檢測指標穩(wěn)定，利于客觀、公正和真實的應用。標準化強調制備模型中的各種技術、劑量和檢測標準應該固定使用，利于模型的穩(wěn)定重現(xiàn)，因此和病原試驗性研究、探索性研究不同。

1.5 生物安全原則

即在病原性動物模型制備過程中，避免經病源污染、動物接觸、污物擴散、樣本采集、意外事件等任何途徑導致實驗室對人員和環(huán)境的生物危害發(fā)生，嚴格按照國家關于病原微生物相關規(guī)定進行。病原微生物的實驗室活動必須按照病原危害等級和防護要求進行。

2 感染性疾病動物模型的分類

目前，國內外沒有嚴格的感染性疾病模型的分類標準，但是，感染性病原動物模型的分類明顯不同于一般動物模型的分類，因此，建議按照病原種類特性以及疾病表現(xiàn)程度應分為以下一些類型。

2.1 完全疾病表現(xiàn)模型

人源性病原體在動物中導致的疾病能全部或基本上擬似人類疾病臨床表現(xiàn)、疾病過程、病理生理學變化、免疫學反應等疾病特征。在感染的動物中必須能檢測到活性病原（病原體內復制）和誘導的特異性免疫抗體（機體改變），這是病原導致疾病的直接證據(jù)，也是模型評判的根本要素。如一些寄生蟲、細菌病原，宿主特異性不高，或一些人獸共患性病毒性病原能在動物上制備的模型。這類模型是最理想的疾病模型，能最大化實現(xiàn)疾病在動物上的再現(xiàn)。

2.2 部分疾病表現(xiàn)模型

人源性病原體在動物中導致的疾病能不全部或部分明顯擬似人類疾病臨床表現(xiàn)、疾病過程、病理生理學變化、免疫學反應等疾病特征，必須能檢測到活性病原和誘導的特異性免疫抗體。如一些原蟲性寄生蟲、細菌病原，或一些病毒性病原不能在動物上表現(xiàn)出完全疾病表現(xiàn)，這類模型也是較理想的疾病模型。

2.3 同類疾病的模型或參比疾病模型

人源性病原體不能在動物中直接致病，但本動物或其他種類動物的相同科、屬、種的病原，或人-動物重組病原導致的疾病能全部或部分明顯擬似人疾病臨床表現(xiàn)、疾病過程、病理生理學變化、免疫學反應等疾病特征，必須能檢測到活性病原和誘導的特異性免疫抗體。如動物源性寄生蟲、細菌病原，病毒性病原在動物上表現(xiàn)出完全類似人類疾病表現(xiàn)，這類模型是較理想的參比疾病模型。

2.4 疾病病理模型

人源性病原體在動物中不能導致明顯的擬似人疾病臨床表現(xiàn)、疾病過程等疾病特征，但病理學變化非常具有特征性、能在動物體內檢測到活性病原和誘導的特異性免疫抗體。如一些寄生蟲、細菌病原，有一定的宿主特異性，或一些病毒性病原常能在動物上出現(xiàn)明顯的病理學改變。這類模型常常成為理想的比較醫(yī)學用疾病模型，如臨床病人不可能動態(tài)取樣了解組織、器官病理改變，而動物模型則能實現(xiàn)實時了解動態(tài)變化，為疾病治療等提供依據(jù)。

2.5 病原免疫模型

導入人源性或其他動物病原體不能在動物中致病，但能引起動物全部或部分明顯擬似人疾病免疫學反應等特征。一般檢測不到活性病原，但能檢測誘導的特異性免疫抗體。如一些宿主性強的寄生蟲、細菌病原和病毒性病原，不能通過自然途徑或體表途徑接種感染而在體內復制，但可通過靜脈、肌肉等免疫途徑導入機體，機體通過處理免疫原的方式產生抗體或細胞免疫。這類模型嚴格意義上講不屬于疾病模型，但是考慮到失活病原體成分也可引起類似疾病和免疫反應，在沒有動物模型的情況下，也是一種選擇。

2.6 基因工程疾病模型

將病原體的遺傳物質（基因）經人工方法導入動物體基因組中，這些基因的表達，引起動物性狀的可遺傳性修飾，同時可能導致動物出現(xiàn)病原致病的某些變化而成為模型。這類模型應該能檢測到導入的病原成分和誘導的特異性免疫抗體。這類模型主要針對一些目前還不能有較理想動物模型的寄生蟲、細菌和病毒病原。

2.7 復合疾病模型

將不同感染性疾病病原感染動物，模擬人多重病原感染疾病的臨床表現(xiàn)、疾病過程、病理生理學變化、免疫學反應等疾病特征，綜合比較研究病原之間的相互作用。如疾病后期的復合感染等。

2.8 群體動物模型

一群動物感染某種病原后，檢測不到全部動物發(fā)病、病原體內復制和出現(xiàn)免疫反應，或病原檢測表現(xiàn)為在不同時間、不同部位，免疫檢測時間不甚一致。此類模型，可通過計算群體動物發(fā)病百分率來進行應用。

2.9 特殊疾病模型

將病原導入免疫缺陷、疾病抵抗、胚胎動物、基因工程動物等特殊類型動物，制備特殊條件下的疾病表現(xiàn)動物模型，研究正常動物可能不會或不易檢測到的疾病改變。

3 感染性疾病動模型的局限性

感染性動物模型畢竟是利用動物，通過人工方式感染，進行模擬研究，尤其是人源性病原體感染動物，往往不會得到和人非常類似的疾病過程，這也是感染性動物模型的局限性，只有認識到這種局限性，才能更好的理解動物模型，正確使用動物模型。另一方面，也使我們思考，病原為什么在不同動物中，表現(xiàn)出致病性的相同或不同，這也是病原性疾病致病機制研究的重點。概括起來，感染性動物模型的局限性包括以下幾個方面。

3.1 動物的局限

動物的種類和等級的限制等因素影響動物模型。不同動物遺傳和生物學特性不同，對病原的感染性會有不同表現(xiàn)，不同種屬、品種、品系的動物也會不同，個體差異也會影響模型的一致性。如禽流感病毒H5N1，可感染小鼠、大鼠、獼猴、食蟹猴、雪貂等不同動物，但其致病性在不同動物有所差異，國外一般推薦使用雪貂作為模型，認為疾病過程和患者類似。但在我國雪貂尚未實驗動物化，來源也較困難。動物的微生物和寄生蟲攜帶情況，即微生物學等級，也影響模型制備，一般推薦無特殊病原體（SPF）動物用于模型制備，影響因素較小。另外，動物也可能被感染后不會全部發(fā)病，一般利用整組動物感染情況（百分數(shù)）作為模型基數(shù)而使用。

3.2 病原的局限

病原的活化程度、來源、培養(yǎng)、量化、標準病原株、地方株等生物學特性的差異等因素，會影響模型的制備。有些病原不能被培養(yǎng)，其他微生物污染干擾等也影響模型制備。病原在動物體內，受到免疫等阻力，也會相應通過變異等方式改變生物學特性。

3.3 實驗方法的局限

方法學不同或實驗室不具備的方法條件會影響模型的指標確定。很多病原存在不同途徑感染問題，想選擇的感染途徑可能不是理想途徑。有些病原需要定量檢測、病理活檢等實驗室條件達不到要求，影響模型的完整性。生物安全要求的實驗室條件，和普通實驗室條件下的動物模型也會出現(xiàn)不同，如艾滋病靈長類模型動物（SIV/SAIDS）在生物安全三級實驗室不會出現(xiàn)像普通環(huán)境下的后期嚴重復合感染情況。

3.4 動物和人體的局限

動物和人體不同，可能使得病原在不同機體表現(xiàn)不同。因此，理論上講，和人類遺傳、進化越接近的動物，可能更能表現(xiàn)出疾病的類似性。但這不是絕對的，病原和不同動物長期相伴，形成了復雜的相互關系，具備了較穩(wěn)固抵抗模式，給模型的制備和疾病分析帶來極大困難。

3.5 應用的局限性

動物的質量和數(shù)量、病原在體內復制的不確定性、檢測方法的特異性、敏感性和重復性、處死動物的頻率和要求、藥物和疫苗的特殊要求等等方面都會影響、限制模型動物的應用。如靈長類動物不可能像小動物一樣要求遺傳均一性和足夠數(shù)量，甚至達到統(tǒng)計學要求的組（只）數(shù)。

4 結語

隨著人類重大感染性疾病的深入研究，相應動物模型的制備和應用越來越廣泛，但是，也出現(xiàn)了一些問題，如不能準確理解此類模型的特性和要求等，針對這些方面的欠缺，本文提出了一些觀點和建議。另外，感染性疾病動模型制備應該做好充分的準備，建議重點包括：

4.1 動物的準備

動物的選擇準備是模型制備成功與否的關鍵。對于成熟的病原動物模型，動物的種類、微生物等級均已明確，應該嚴格按照模型要求制備。對于初次、新發(fā)病原、新動物的模型制備，首先應該進行動物的種類和等級選擇、感染性確定（病原屬性、劑量、途徑等）等篩選性實驗，也即預實驗。篩選出敏感、穩(wěn)定的動物（種類、年齡、性別等）后，進行標準化模型制備。同時，實驗動物的倫理和福利原則也應得到滿足。

4.2 病原的準備

病原的活化狀態(tài)和特性是模型制備成功的首要條件。標準病原株、地方株等生物學特性的標準化確定等也需提前完成。

4.3 方法的準備

病原感染途徑、劑量、感染環(huán)境控制以及檢測方法等應該是規(guī)范、成熟、穩(wěn)定的。方法、技術達不到上述要求，會在不同程度上影響動物模型的一致性。

4.4 檢測指標的準備

動物模型的成功與否，關鍵體現(xiàn)在模型動物的疾病表現(xiàn)和指標檢測，也就是說，對于一種感染性疾病模型，應該預先確定觀察、檢測哪些表現(xiàn)疾病關鍵的特征性指標，尤其是臨床表現(xiàn)、病原學指標、病理生理性指標和免疫學指標以及其他輔助性指標的確定。

4.5 模型整體分析準備

通過上述疾病表現(xiàn)和指標檢測，明確模型屬于哪類模型，綜合評價模型的應用程度和范圍等。

4.6 影響因素的排除

在感染性疾病動物模型制備過程中的每個環(huán)節(jié)，都會出現(xiàn)影響動物模型質量的因素，如動物因素、病原因素、技術方法因素、環(huán)境因素等等。因此，力求控制這些影響因素，達到模型的規(guī)范化、標準化要求，顯得非常重要。

［1］Fouchier R，Kuiken T，Schutten M，et al.Koch’postulates fulfilled for SARS virus［J］.Nature，2003，423：240-241.

［2］Gibbons RJ.Infectiousdiseases［M］.Philadelphia：WB.Saunders Co.，1992.

［3］Paul WE.Fundamental immunology（the 4thedition）［M］.New York：Plenum Press，1998.

［4］秦川.醫(yī)學實驗動物學［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008.

［5］施新猷.人類疾病動物模型［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008.