黎小瓊 綜述 黃憲章 審校 (廣東省中醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣州510120)

CD95/CD95L系統(tǒng)是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要途徑,在人體自身耐受機(jī)制、誘導(dǎo)活化細(xì)胞凋亡、控制免疫應(yīng)答和參與免疫豁免中均起重要的作用。然而近年來新的研究發(fā)現(xiàn)CD95/CD95L不僅能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡還可促發(fā)多重信號通路抑制細(xì)胞凋亡,其表達(dá)異常與腫瘤以及某些自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展有著密切聯(lián)系。

1 CD95、CD95L的分子特征與分布

1.1 CD95 CD95屬于腫瘤壞死因子受體(TNF-R)及神經(jīng)生長因子受體(NGF-R)家族成員的Ⅰ型跨膜蛋白。人CD95基因定位于染色體10q24.1區(qū),包含8個內(nèi)含子及9個外顯子,其基因編碼產(chǎn)物分子量約為45 kD。分子結(jié)構(gòu)包括3個部分,即胞膜外的N末端區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿的C末端區(qū)。膜外區(qū)即信號肽區(qū),其氨基酸序列相對保守且有膜受體特征;跨膜區(qū)位于分子結(jié)構(gòu)的中段;胞漿區(qū)分為死亡抑制域和死亡結(jié)構(gòu)域,后者在傳遞凋亡信號中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用,其氨基酸突變可阻止凋亡信號傳導(dǎo)。CD95主要以膜受體的形式存在,人外周血中也有可溶性CD95(sCD95)存在。mCD95與sCD95的區(qū)別在于有無跨膜區(qū),sCD95分子是由于異常拼接的轉(zhuǎn)錄翻譯所致,編碼跨膜區(qū)的63個堿基對缺失,致使翻譯產(chǎn)物缺乏跨膜區(qū)而呈可溶性分泌。

CD95為非譜系特征性抗原,廣泛表達(dá)于胸腺細(xì)胞、活化的T和B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞及單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞,也可存在于肝、肺等實(shí)體組織細(xì)胞,以及內(nèi)皮細(xì)胞和多種上皮細(xì)胞的表面。

1.2 CD95L CD95L是屬于TNF家族的Ⅱ型跨膜蛋白,其N末端位于胞漿,C末端位于胞外。人CD95L基因位于染色體1q23上,由5個外顯子組成,分子量40 kD。膜結(jié)合的CD95L(mCD95L)通過金屬蛋白酶介導(dǎo)的蛋白水解作用產(chǎn)生可溶性CD95L(sCD95L),而三聚體形式的 sCD95L才具有功能。sCD95L一方面可作為拮抗劑,與mCD95L競爭結(jié)合受體;另一方面通過結(jié)合到基質(zhì)成分而轉(zhuǎn)變成激動劑。sCD95L還具有化學(xué)趨化性,可促進(jìn)中性粒細(xì)胞和吞噬細(xì)胞遷移。

CD95L主要在活化的T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞表面表達(dá),而在巨噬細(xì)胞以及睪丸、視網(wǎng)膜和某些腫瘤等非免疫組織中少量表達(dá)[1]。

2 CD95/CD95L與細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡,是機(jī)體清除感染、變異及衰老細(xì)胞并維持自身穩(wěn)定的主要調(diào)節(jié)方式。目前認(rèn)為凋亡主要通過CD95/CD95L系統(tǒng)調(diào)控[2]。mCD95L或競爭性抗體激活敏感細(xì)胞后,CD95胞質(zhì)區(qū)經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后修飾,即半胱氨酸位點(diǎn)的S-亞硝基化[3],致使其死亡結(jié)構(gòu)域相互聚集,形成三聚體并募集到脂筏,三聚體的死亡結(jié)構(gòu)域與適配體(Fas-associated death domain protein,FADD)肽鏈C端的死亡結(jié)構(gòu)域相連,而FADD肽鏈N端含有死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域,可以集聚胱天蛋白酶8(caspase-8)的酶原,形成凋亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物(Death-inducing signaling complex,DISC),然后使得caspase-8活化并將凋亡信號向下傳遞。caspase-8至少可通過兩條已知的通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡:(1)直接活化caspase-3;(2)通過凋亡誘導(dǎo)蛋白BID改變線粒體跨膜電位,促進(jìn)位于線粒體膜間隙的細(xì)胞色素c釋放到細(xì)胞漿內(nèi),通過活化caspase-9,致使caspase-3活化。caspase-3為細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的關(guān)鍵效應(yīng)酶,其活化最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。該通路還受到細(xì)胞型含死亡域的Fas結(jié)合蛋白樣白介素1β轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白(cellular FADD-like interleukin-1βconverting enzyme inhibitory protein,c-FLIP)的負(fù)性調(diào)控,c-FLIP通過與caspase-8競爭募集到FADD,從而抑制該死亡受體信號通路和caspase-8的活化,但是研究顯示c-FLIP在抑制DISC中caspase-8活化的同時導(dǎo)致caspase-8誘導(dǎo)其裂解[4]。

3 CD95/CD95L與非凋亡應(yīng)答

3.1 CD95/CD95L的非凋亡活性 最近研究顯示,sCD95L通過激活CD95后可調(diào)節(jié)組織再生,促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和細(xì)胞因子的產(chǎn)生,促進(jìn)自身免疫和腫瘤的發(fā)生,表明CD95L亦存在非凋亡活性[5]。

眾多研究顯示CD95/CD95L系統(tǒng)可促進(jìn)細(xì)胞生長,如CD95可促進(jìn)鼠肥大細(xì)胞成熟,成纖維細(xì)胞和成熟的樹突狀細(xì)胞生長及T細(xì)胞增殖[6,7]。CD95活化絲氨酸激酶可促進(jìn)惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)展[8];由于CD95L的致瘤活性和缺少凋亡誘導(dǎo),大量表達(dá)sCD95L的小鼠可出現(xiàn)巨大的組織肉瘤[5];許多腫瘤細(xì)胞系通過自身分泌CD95L并作用于CD95,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長[9]。給小鼠注射抗CD95特異性抗體或CD95L可導(dǎo)致抗凋亡信號通路的活化,如Akt,STAT3和NF-κB及抗凋亡因子Bcl-2表達(dá)的改變,從而加速局部肝切除術(shù)后小鼠的肝臟再生。

“免疫豁免”現(xiàn)象表明炎癥反應(yīng)的發(fā)展可被抑制,避免炎癥對個別組織完整性和正常功能的破壞,如眼睛的前房、睪丸、胎盤等,其中一個重要的機(jī)制是這些組織表達(dá)CD95L,誘導(dǎo)CD95+的炎癥細(xì)胞凋亡。以往認(rèn)為引進(jìn)CD95L到移植物中可減少排斥反應(yīng),但大量研究發(fā)現(xiàn)CD95L并不能對移植物起保護(hù)作用。相反,在某些環(huán)境中,CD95L可下調(diào)中性粒細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞的粘附,促進(jìn)中性粒細(xì)胞募集到炎癥區(qū)域。研究表明T細(xì)胞產(chǎn)生大量的CD95L既可以抑制天然T細(xì)胞存活,又可以介導(dǎo)非凋亡活性,在表達(dá)CD95的組織中誘導(dǎo)炎性因子產(chǎn)生,從而加重疾病[10,11]。

3.2 CD95/CD95L非凋亡應(yīng)答的相關(guān)信號通路 近來,CD95/CD95L非凋亡信號通路備受關(guān)注。CD95L的非凋亡活性可促進(jìn)自身免疫和腫瘤的發(fā)生,通過NF-κB通路,MAPK 通路(ERK1/2,p38,JNK1/2)及PI3K通路介導(dǎo),刺激細(xì)胞存活和增殖,促進(jìn)趨化因子產(chǎn)生和炎癥反應(yīng),甚至調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移和侵襲[12]。

觸發(fā)CD95產(chǎn)生存活或死亡的信號取決于刺激的強(qiáng)度[13,14]。CD95誘導(dǎo)的凋亡需要兩個具有功能的CD95等位基因才能確保有效的DISC形成,相比之下NF-κB的信號激活閾值明顯較低,僅一個具有功能的CD95等位基因也能被激活,此外低濃度抗CD95抗體的刺激并不能促發(fā)死亡信號,而是活化MAPK,因此CD95可能通過NF-κB和MAPK 通路,促存活基因表達(dá)和誘導(dǎo)致瘤,提示CD95信號的強(qiáng)度對胞內(nèi)凋亡通路的變化起著重要作用。

這些非細(xì)胞毒性級聯(lián)反應(yīng)抑制促凋亡通路的同時受配體蛋白和受體內(nèi)在化的進(jìn)程調(diào)控。CD95胞內(nèi)區(qū)域兩個受體位點(diǎn)調(diào)節(jié)其非凋亡活性,Tyr291促進(jìn)CD95內(nèi)在化,Cys199則調(diào)節(jié)受體聚集及定位到脂筏。CD95L刺激CD95后磷酸化水平提高并定位到脂筏,同時使Akt和ERK磷酸化,且通過CD95L的交聯(lián),轉(zhuǎn)錄因子NFAT和AP-1活化后導(dǎo)致IFN-γ生成增加,從而促進(jìn)炎癥的發(fā)生。

此外,c-FLIP在細(xì)胞活化、增殖和分化中也起重要作用[15]。短亞型和長整亞型的FLIP亞型活性不同,后者可聚集腫瘤壞死因子相關(guān)因子(TRAF)1、TRAF2、Raf-1及RIP1,從而激活ERK 和NF-κB通路,最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖及炎癥發(fā)生。

4 CD95/CD95L與相關(guān)疾病

4.1 CD95/CD95L與腫瘤 研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中,CD95L的表達(dá)增加,而CD95表達(dá)下調(diào)[6]。各種研究結(jié)果顯示CD95L激活人腫瘤細(xì)胞表面的CD95,誘導(dǎo)趨化因子的產(chǎn)生并最終導(dǎo)致促炎細(xì)胞的募集,提示CD95與炎癥反應(yīng)有關(guān),并促進(jìn)腫瘤生長[14];Chen等[9]對各種人腫瘤細(xì)胞、自發(fā)或損害誘導(dǎo)卵巢癌和肝癌的小鼠模型進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)下調(diào)或抑制CD95的表達(dá)可抑制腫瘤生長,且腫瘤自身分泌的CD95L為其生長所需;Watson等[16]發(fā)現(xiàn)在食管腺癌細(xì)胞漿中,低水平表達(dá)的CD95L可激活MAPK通路,發(fā)揮促進(jìn)腫瘤生長的作用?？梢奀D95L-CD95信號對腫瘤生長起重要作用。此外,CD95的激活還可促進(jìn)成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的侵襲轉(zhuǎn)移,主要機(jī)制為CD95激活后誘導(dǎo)絲氨酸家族成員Yes和PI3K亞基p85的募集從而激活PI3K,而活化的PI3K反向抑制糖原合酶激酶3-β的活性,誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá),最終提高細(xì)胞的侵襲性[8]。基因芯片分析已證實(shí)在腫瘤細(xì)胞系中潛在大量促腫瘤細(xì)胞侵襲的候選基因可被CD95L調(diào)控轉(zhuǎn)錄,例如尿激酶纖溶酶原激活物和絲/蘇氨酸蛋白激酶SNARK。此外,人類腫瘤細(xì)胞中CD95死亡結(jié)構(gòu)域失活突變率較高,其失活突變與細(xì)胞凋亡信號通路的受阻存在正相關(guān),但它們通常為等位基因的單一點(diǎn)突變,提示不完全突變的基因受體可維持致瘤優(yōu)勢[17]。

4.2 CD95/CD95L與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CD95/CD95L系統(tǒng)在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)的病理過程中至關(guān)重要。RA關(guān)節(jié)中的免疫細(xì)胞抵制CD95L介導(dǎo)的凋亡,導(dǎo)致炎癥因子聚集及維持炎癥過程,并促進(jìn)骨質(zhì)破壞[18]。Palao等[19]研究發(fā)現(xiàn)刺激CD95后,并依賴caspase的活性和FLIP表達(dá),可活化NF-κB和AP-1,從而增強(qiáng) RA滑膜細(xì)胞的促炎特性,表明FLIP是CD95信號通路凋亡和促炎現(xiàn)象轉(zhuǎn)換的重要分子。阻止膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎中巨噬細(xì)胞CD95-CD95L相互聯(lián)系可抑制NF-κB活化及IL-1β或脂多糖誘導(dǎo)細(xì)胞因子的表達(dá),該機(jī)制是通過FADD與Toll樣受體(TLR)配體蛋白MyD88的相互作用介導(dǎo),提示CD95-CD95L相互作用可能通過IL-1受體1或TLR4通路促進(jìn)慢性關(guān)節(jié)炎。

4.3 CD95/CD95L與肥大性心肌炎 sCD95、mCD95及CD95L分子通過細(xì)胞因子和趨化因子,誘發(fā)大量的炎癥反應(yīng)。因此,許多慢性炎癥疾病可通過減少這些分子而緩解病情,如心肌炎。許多研究人員在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ突蛉诵募≈幸炎C實(shí),CD95的活化可加重炎癥并導(dǎo)致心肌肥厚和功能障礙。循環(huán)中sCD95L的濃度與已經(jīng)存在的左心室肥厚有關(guān),亦與左心室重量指數(shù)和舒張壓呈正相關(guān)。

4.4 CD95/CD95L與感染 研究表明由細(xì)菌感染引起的額外介質(zhì)如LPS或肽聚糖等可激活中性粒細(xì)胞,促發(fā)由活化的CD95介導(dǎo)的非凋亡途徑,最終導(dǎo)致細(xì)胞因子或趨化因子的分泌和炎癥的發(fā)生[20]。利用CD95L點(diǎn)突變的gld小鼠制成克氏錐蟲感染性心肌炎的模型,可觀察到心肌細(xì)胞內(nèi)較輕微的炎癥因子浸潤,說明CD95L基因的表達(dá)與心肌炎有密切的關(guān)聯(lián)[21]。而有研究發(fā)現(xiàn)在感染利什曼蟲的C57BL/6小鼠中,CD95/CD95L通路參與減輕該蟲對自身造成的損害的過程,CD95L和IFN-γ可提高巨噬細(xì)胞的活化,導(dǎo)致TNF、IL-6和NO的分泌增多,最終造成對胞內(nèi)利什曼蟲的殺傷。表明CD95L與IFN-γ的協(xié)同作用可活化巨噬細(xì)胞,通過FCD95/CD95L促發(fā)的非凋亡事件有利于控制利什曼蟲感染的發(fā)病過程[22]。

5 問題與展望

CD95通過調(diào)控細(xì)胞死亡和存活,可維持機(jī)體自身穩(wěn)定。通過對CD95/CD95L的深入研究,人們重新認(rèn)識了該系統(tǒng)的生理和病理功能。目前認(rèn)為,結(jié)合不同的因子,CD95信號可誘發(fā)不同結(jié)果的動態(tài)過程。CD95可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長,提示抑制CD95的效應(yīng)而不是促進(jìn)其活性可作為治療疾病的研究方向。由于CD95是全身性活化,故針對致病細(xì)胞的靶向治療也將是挑戰(zhàn),此外確定與CD95非凋亡信號通路相關(guān)的信號組分,可提供新的靶點(diǎn)?？傊?進(jìn)一步深入探討CD95系統(tǒng)的具體作用機(jī)制,細(xì)胞內(nèi)與臨床表現(xiàn)的聯(lián)系,將為研究腫瘤及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制及尋求有效的治療策略提供方向。

1 Mabrouk I,Buart S,Hasmim M et al.Prevention of autoimmunity and control of recall response to exogenous antigen by Fas death receptor ligand expression on T cells[J].Immunity,2008;29(6):922-933.

2 Ramaswamy M,Siegel RM.A FAScinating receptor in self-tolerance[J].Immunity,2007;26(5):545-547.

3 Leon L,Subramaniam S,Cauvard O et al.S-Nitrosylation of the Death Receptor Fas Promotes Fas Ligand-Mediated Apoptosis in Cancer Cells[J].Gastroenterology,2011;140(7):2009-2018.

4 Kataoka T,Tschopp J.N-terminal fragment of c-FLIP(L)processed by caspase8 specifically interacts with TRAF2 and induces activation of the NF-kappaB signaling pathway[J].Mol Cell Biol,2004;24(7):2627-2636.

5 O'Reilly LA,Tai L,Lee L et al.Membrane-bound but not Secreted Fas Ligand Is Essential for Fas-Induced Apoptosis[J].Nature,2009;461(7264):659-663.

6 Berent-Maoz B,Gur C,Vita F et al.Influence of FASonmurinemast cell maturation[J].Ann Allergy Asthma Immunol,2011;106(3):239-244.

7 姚三巧,LU Yongju,WANG Liying et al.Fas配體對NIH3T3增殖和膠原表達(dá)的信號機(jī)制研究[J].中國職業(yè)醫(yī)學(xué),2010;37(2):91-94.

8 Kleber S,Sancho-Martinez I,Wiestler B et al.Yes and PI3K bind CD95 to signal invasion of glioblastoma[J].Cancer Cell,2008;13(3):235-248.

9 Chen L,Park S M,Tumanov A V et al.CD95 promotes tumour growth[J].Nature,2010;465(7297):492-496.

10 Ko G J,Jang H R,Huang Y et al.Blocking fas ligand on leukocytesattenuateskidney ischemia-reperfusion injury[J].J Am Soc Nephrol,2011;22(4):732-742.

11 Paulsen M,Valentin S,Mathew B et al.Modulation of CD4+T-cell activation by CD95 co-stimulation[J].Cell Death Differ,2011;18(4):619-631.

12 Wisniewski P,Ellert-Miklaszewska A,Kwiatkowska A et al.Non-apoptotic Fas signaling regulates invasiveness of glioma cells and modulates MMP-2 activity via NFkappaB-TIMP-2 pathway[J].Cell Signal,2010;22(2):212-220.

13 Lavrik IN,Golks A,Riess D et al.Analysis of CD95 threshold signaling:triggering of CD95(FAS/APO-1)at low concentrations primarily results in survival signaling[J].J Biol Chem,2007;282(18):13664-13671.

14 Matsumoto N,Imamura R,Suda T.Caspase-8-and JNK-dependent AP-1 activation is required for Fas ligand-induced IL-8 production[J].FEBS J,2007;274(9):2376-2384.

15 Fricker N,Beaudouin J,Richter P et al.Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro-and antiapoptotic role of c-FLIPL[J].JCell Biol,2010;190(3):377-389.

16 Watson G A,Naran S,Zhang X et al.Cytoplasmic overexpression of CD95L in esophageal adenocarcinoma cells overcomes resistance to CD95-mediated apoptosis[J].Neoplasia,2011;13(3):198-205.

17 Peter M E,Legembre P,Barnhart B C.Does CD95 have tumor promoting activities?[J].Biochim Biophys Acta,2005;1755(1):25-36.

18 Du F,Wang L,Zhang Y et al.Role of GADD45 betain the regulation of synovial fluid T cell apoptosis in rheumatoid arthritis[J].Clin Immunol,2008;128(2):238-247.

19 Palao G,Santiago B,Galindo MA et al.Fas activation of a proinflammatory program in rheumatoid synoviocytes and its regulation by FLIP and caspase 8 signaling[J].Arthritis Rheum,2006;54(5):1473-1481.

20 Alvarez ME,Bass JI F,Geffner JR et al.Neutrophil signalingpathways activated by bacterial DNA stimulation[J].J Immunol,2006;177(6):4037-4046.

21 de Oliveira G M,Diniz R L,Batista W et al.Fas ligand-dependent inflammatory regulation in acutemyocarditis induced by Trypanosomacruzi infection[J].Am JPathol,2007;171(1):79-86.

22 Chakour R,Allenbach C,Desgranges F et al.A new function of the Fas-FasL pathway inmacrophage activation[J].JLeukoc Biol,2009;86(1):81-90.