陳穎 王瑋,2

(1.中國檢驗檢疫科學研究院 北京 100123;2.中國農業(yè)大學食品學院)

1 前言

食物過敏是一種人體對食物中抗原物質產生的由免疫介導的不良反應,嚴重時可能產生過敏性休克,甚至危及生命,目前已成為全世界關注的公共衛(wèi)生熱點問題[1]。據統(tǒng)計,全世界約有 2%-3%的成年人和 5-8%的兒童患有食物過敏癥,其中90%以上的食品過敏來自小麥、花生、大豆、堅果類、牛奶、雞蛋、魚和甲殼類食物[2]。隨著食品工業(yè)的迅速發(fā)展,人們的飲食習慣和食品種類發(fā)生了很大變化,因食品致敏的患者數量也日益增多,越來越影響到人類的生活質量和生命安全。為保障公眾健康,很多國家和地區(qū)先后出臺了相關的法律法規(guī),要求明確標簽、標識食品中的過敏原成分。食品法典委員會 (CAC)關于食物過敏標識的問題,在《預包裝食品標識法典通用標準》中要求,對于所有已知可導致過敏反應的食品和配料都應加以說明。歐盟公布第 2003/89/EC號指令規(guī)定食品標簽必須列明多類致敏成分,要求成員國從 2005年 11月 25日起禁止銷售不符合標簽規(guī)定的產品。美國自2006年 1月 1日起已開始實施新的強制性的《食品過敏原標識和消費者保護法規(guī)》(FALCPA),要求食品標簽上必須標識致敏原成分種類,并規(guī)定了標識方式;對于含有未聲明過敏原的食品,美國 FDA要求召回。日本厚生省《食品衛(wèi)生法》規(guī)定必須清楚標示蛋、牛乳、小麥、蕎麥及花生等 5種主要致敏原成分。香港地區(qū)從 2007年 7月 9日開始執(zhí)行過敏原標識制度《食品及藥物 (成分組合及標簽)規(guī)例》,強調了對于甲殼類魚類等水產品、花生和堅果的過敏原標識。我國在 2008年奧運會期間編制了《奧運會食品安全食品過敏原標識標注》,首次出現(xiàn)了對過敏原標識的要求,但該標準卻隨奧運會的結束而終止。2010年我國根據《食品安全法》規(guī)定和國務院有關部門建議,借鑒國外發(fā)達國家的對過敏原標識的管理辦法,修訂現(xiàn)行 GB/T23779-2009預包裝食品中的致敏原成分,增加食物過敏原標示要求。

由于由于發(fā)達國家對進口食品過敏原標識越來越嚴格的要求,食物過敏原甚至成為國際食品進出口貿易壁壘的新手段。為保證過敏原標簽、標識制度的實施,各國研究者紛紛開展了針對過敏原檢測方法的研究。本文針對目前常見的兩類檢測方法——免疫學檢測方法和核酸檢測方法的研究進展進行綜述和分析。

2 針對過敏蛋白的免疫學檢測方法

引起食物過敏的主要成分是分子量介于 10000-70000之間的蛋白或糖蛋白,針對這類蛋白的檢測主要采用免疫學檢測方法,包括放射過敏原吸附抑制實驗 (RAST)、酶標記過敏原吸附抑制實驗(EAST)、火箭免疫電泳 (R IE)、免疫印跡法 (I B)和酶聯(lián)免疫法 (EL ISA)等。

2.1 RAST或 EAST

RAST或 EAST主要應用于食物過敏的臨床診斷,同時也應用于食物過敏原的定性檢測及多種食物中潛在致敏性的評價。RAST/EAST的檢測原理是抗原在固相載體上與特定人群血清中的 IgE結合,樣品中的抗原與固定相上的抗原競爭結合 IgE,加入一種抗 IgE的同位素或酶標記抗體,并加入可改變顏色或者能發(fā)光的底物用于檢測結合 IgE的抗體。此兩種方法的弊端主要在于無法獲取過敏人群的血清,評價方法的標準化較為困難。

2.2 RIE

R IE使用含有抗體的凝膠,被檢測分析的抗原根據自身的電泳能力在凝膠中遷移直至抗體與抗原結合,所形成的電泳峰高與待檢抗原含量成正比例。該法的局限在于凝膠的制備及免疫環(huán)節(jié)的操作步驟比較繁瑣。

2.3 IB

IB主要用于半定量檢測食物樣品中的過敏蛋白,首先提取樣品蛋白噴灑于硝酸纖維素膜或 PVPF膜上,用酶標記抗體與目標抗原進行結合反應,酶與底物反應顯現(xiàn)出有顏色的斑點,斑點的深淺與抗原的含量成比例。

2.4 EL ISA

EL ISA法是用特定的蛋白或者抗原與特定的酶標記抗體結合后用顯色反應來定性和定量,與前述方法相比 (R IE和 I B方法是定性和半定量方法,RAST和 EAST是定量分析方法),它因其準確性高、操作簡便及標準化的可能性,常用于食品安全和臨床檢驗等領域。EL ISA方法檢測食物過敏原的方式主要有競爭 EL ISA和夾心 EL ISA方法兩種。例如,國外研究者利用固相載體上的抗體捕捉過敏原,然后用酶標記的二抗形成夾心抗,檢測腰果特異性蛋白,檢測靈敏度可達 1.0μg/g,但其他堅果類如美洲山核桃、胡桃、開心果和葵花籽之間卻存在著交叉反應,限制了 EL ISA法的應用范圍[3]。EL ISA方法在檢測蝦過敏原時,利用原肌球蛋白特異性抗體,檢測限為 2.5μg/g,但蝦與龍蝦、蟹等其他甲殼類之間卻存在著顯著的交叉反應[4]。脊椎動物原肌球蛋白雖與蝦原肌球蛋白幾乎存在 55%的同源性,但蝦與含有原肌球蛋白的雞和豬等脊椎動物卻無交叉反應[5]。近年國內研究者建立了檢測牛乳中β-乳球蛋白的間接競爭 EL ISA法,檢測限范圍在 0.05-1.00μg/mL之間[6]。還有些研究者利用雙抗體夾心 EL ISA法分別檢測食物中大豆、牛奶、蝦及花生過敏原蛋白成分,其最低檢測限分別為 100 ng/mL[7]、25 ng/mL[8]、40 ng/mL[9]和 8 ng/mL[10]。

隨著試劑生產技術的發(fā)展和標記物的應用,檢測食物過敏原的商業(yè)化試劑盒也應運而生,EL ISA試劑盒可檢測和定量食物中過敏原成分,如花生蛋白 (0.1-5μg/g)、榛子蛋白 (1-10μg/g)、小麥蛋白(1.5-10μg/g)和大豆蛋白 (1-5000μg/g)等。然而 EL ISA試劑盒在檢測魚過敏原時,雖可檢測出魚釋放的組胺成分,但并不適用于魚過敏原蛋白的檢測[11]。

EL ISA方法的特異性和靈敏性主要依賴于抗體識別食物過敏原,但食品工業(yè)常利用熱處理、焙烤和酶解等深加工技術,這些技術可使過敏原蛋白發(fā)生變性和降解,而蛋白質結構的改變又可干擾蛋白提取物或抗體結合部位,會導致假陰性結果的出現(xiàn)。此外,對于某些過敏原,由于缺少特異性的單克隆抗體,無法利用 EL ISA法進行檢測。

3 針對致敏食品的核酸檢測方法

多聚酶鏈式反應 (PCR)技術起始于 20世紀 90年代中期,但食物過敏原的 PCR檢測法憑借自身顯著的優(yōu)勢,已逐漸取代 EL ISA法成為官方的食品安全檢測機構或實驗室的主流檢測方法[11]。PCR法主要又可分為普通凝膠 PCR和熒光定量 PCR兩種。普通凝膠 PCR技術檢測結果只是定性方法,但可利用合適的內標物,進行半定量檢測分析;而熒光定量 PCR法因其整個反應過程在密閉管中進行,無需反應結束后的電泳分析,因此可降低反應的污染率,這樣利用熒光定量 PCR法代替普通 PCR法進行多種基因的檢測越來越普遍。

與免疫學方法相比,PCR技術可通過引物優(yōu)化和基因靶序列的合理選擇來克服交叉反應的影響。對于缺乏特異性單抗的過敏原,PCR法可利用已知過敏原的基因序列實現(xiàn)檢測。例如,Christine Hupfer等基于芹菜管家基因 Mtd,建立實時熒光PCR技術檢測食物中的芹菜成分,檢測限可達 5-10μg/g[12]。 I.Lo′pez-Calleja等利用 PCR技術擴增線粒體 12S rRNA基因,從綿羊和山羊奶酪中檢測出了牛奶成分,檢測靈敏度為 1.0%[13];還從水牛奶 (water buffalo milk)和意大利干酪中檢測出了牛奶 (cows′milk)成分 ,檢測靈敏度為 0.1%[14]。Rene′Ko¨ppel等利用榛果過敏原 Cor a 1基因、花生過敏原 Ara h 2基因、大豆內源基因 Lectin、牛線粒體 tRNA-Lys基因、雞轉化生長因子β-3基因等,建立多重實時熒光 PCR方法,從食物中檢測出致敏性食物榛果、花生、大豆、牛和雞等成分,實驗結果顯示出較好的特異性和靈敏性 (0.01%)[15]。此外,Fran?oise Nau等利用線粒體細胞色素 b基因設計特異性引物進行 PCR擴增,從雞蛋制品中可分辨出火雞蛋、鴨蛋和珍珠雞蛋成分[16]。而鑒定魚種類的 PCR方法主要是利用線粒體 DNA,盡管 5S r DNA、12S rRNA、16S rRNA及運鐵蛋白等基因也能達到鑒定效果,但現(xiàn)普遍采用線粒體細胞色素 b基因進行魚類物種鑒定[17]。

針對含麩質的谷類成分,R′emiAlary等運用定量 PCR方法,通過擴增普通小麥嘌呤吲哚蛋白 (puroindoline-a)基因和硬粒小麥脂質轉移蛋白 (Lipid transfer protein)基因,從栗子粉中檢測出谷類作物;Daniela Zeltner利用小麥高分子量麥谷蛋白 (HMW Glutenin B1-1)基因、黑麥 HMW Glutenin R-1基因和大麥醇溶蛋白(Hor 3)基因設計特異性引物和探針,建立了實時熒光 PCR法檢測食物中的麩質谷物方法[18]。國內研究者欒鳳俠等利用小麥過敏原基因 (γ-醇溶蛋白基因)設計特異引物和探針,通過實時熒光 PCR法從食品中檢測出小麥成分[19]。曹際娟等選擇大麥管家基因 Hordein、小麥管家基因Glmdin、黑麥管家基因 Secl和燕麥管家基因 Avenin作為物種鑒定的特異性標記基因,利用實時熒光PCR方法檢測出食品中含麩質的谷類大麥、小麥、黑麥和燕麥成分[20]。

此外,PCR方法還可減少生物學相近物種間的交叉反應和假陽性結果,研究者常利用大豆內源基因 Lectin、大豆主要過敏原 Glym Bd 30K基因和 Gly m Bd 28K基因進行 PCR擴增來檢測大豆過敏原。研究還表明,選用 Gly m Bd 30K基因可增強大豆與其他豆科植物的鑒別能力[21]。還有研究者建立一種實時熒光 PCR法,通過擴增花生過敏原特征基因序列如 Ara h 2基因、Ara h 3基因和 Ara h 4基因,用于檢測花生過敏原,且Ara h 3基因較其他兩類過敏原基因,檢測靈敏度更高[22]。Alexandra Ehlert等利用實時熒光 PCR方法擴增腰果主要過敏原 Ana o3基因,可特異靈敏地檢測出食物中腰果成分,檢測限可達 2.0μg/g[23]。

PCR法在食物過敏原檢測方面雖具有特異性和靈敏性等優(yōu)勢,但 PCR法無法檢測出過敏原蛋白,因此檢測結果不能與食物的真正致敏性相關。并且食品在加工處理后對蛋白和 DNA的影響也存在著差異,某些加工程序可能致使蛋白和 DNA被分離,無法驗證食物中是否真正存在過敏原蛋白。但PCR方法對于進出口食品中潛在過敏原可起到預警和快速檢測作用,為進一步確認食物中是否存在過敏原提供參考。

4 EL ISA與 PCR方法的比較

目前,EL ISA和 PCR方法皆適用于小麥、大豆、榛子、谷物和花生等食物的檢測,兩者實驗結果之間存在較好的相關性,并且有不同的適用檢測對象[24]。

但 EL ISA方法因自身具有較低復雜度的特異蛋白識別位點,易受到食物基質中所含糖、醛等物質的影響,改變其免疫原性。如果標記蛋白或標記的抗原決定簇在食品加工后受到破壞,這可能導致實驗結果的假陰性,而且用動物抗體檢測的抗原決定簇無法真正地反映出過敏患者識別的過敏原決定簇。

PCR方法對于檢測具有較低DNA含量的食物,如牛奶、雞蛋蛋白、植物油或動物脂肪,尚存在一些問題。對于這些樣品的檢測,基于蛋白的 EL ISA也許比 PCR更為適用,同時又因 DNA不具有組織的特異性,PCR技術無法分辨雞蛋和雞肉、牛奶和牛肉之間的差異,導致實驗結果的假陰性或假陽性。但 PCR法在復雜食品中過敏原的定量分析及物種鑒定方面,卻具有其他方法無法比擬的優(yōu)點,這使PCR方法在動植物源性食物過敏原檢測方面,存在極大的優(yōu)勢,適合國際法規(guī)所要求的食品中痕量過敏原的檢測原則。

5 展望

隨著全球經濟一體化和食品貿易國際化,食物過敏癥問題逐漸受到各國的關注,食物過敏原檢測迫切需要一種快速、準確、高通量的體外檢測方法。目前針對致敏原的檢測方法主要還是以蛋白和DNA為檢測目標,然而,EL ISA方法檢測食物過敏原依賴于過敏原蛋白和眾多質量穩(wěn)定的動物抗體;PCR方法以簡單、確定的 DNA序列為基礎,適用于復雜食品中過敏原的定量分析。但兩種方法在處理較多樣品時操作繁雜,無法解決多種過敏原的同時檢測。

由于現(xiàn)代科學技術的發(fā)展,新型的檢測技術層出不窮,其中普通基因芯片技術以其高準確性、高靈敏度、高通量的優(yōu)勢逐漸成為食物過敏原研究的熱點。但是,基因芯片技術在核苷酸雜交反應之后還需通過專業(yè)的熒光掃描系統(tǒng)進行結果分析,這往往給僅配備簡單實驗儀器的一線實驗室在使用上帶來很多不便之處?？梢曅酒夹g作為一種利用特異探針雜交產生肉眼可見信號的基因芯片技術,現(xiàn)已成功應用于轉基因作物[25]和食源性致病菌[26]等方面的檢測。該技術可對多種靶基因同時檢測和鑒定,實驗結果可以直接通過肉眼進行判定,無需昂貴的信號分析系統(tǒng),同時還可滿足檢測精確度和靈敏度的要求,而且響應迅速,操作簡便,成本低廉并能解決現(xiàn)場檢測和在線檢測問題[27]。因此,可視芯片技術的出現(xiàn)為食物過敏原的研究、分析及檢測開辟了一個嶄新的空間。

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