李東，申元英

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）于1966年被發(fā)現(xiàn)，屬于嗜肝 DNA 病毒科，是全球傳染性肝病的主要病因之一?，F(xiàn)已證明 HBV 除肝細(xì)胞外還有泛嗜性[1]，可存在于除肝臟以外的其他組織細(xì)胞中，外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）也是其靶細(xì)胞之一。由于PBMC是 T和B 淋巴細(xì)胞?巨噬細(xì)胞?NK 細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞的集合體，其在機(jī)體免疫過程中具有重要作用，因此在PBMC 中發(fā)現(xiàn) HBV DNA 及其對(duì)機(jī)體所產(chǎn)生的影響已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注?，F(xiàn)就近來感染 HBV的PBMC 相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 HBV 對(duì) PBMC 具有感染性

PBMC是一群在機(jī)體的免疫應(yīng)答中起重要作用的單形核白細(xì)胞。1984年Oon和Ding[2]證實(shí)在淋巴細(xì)胞液和部分顆粒內(nèi)可檢測(cè)到 HBsAg和HBeAg的存在。其后，國(guó)內(nèi)外的諸多學(xué)者運(yùn)用 southern 雜交技術(shù)證實(shí)了乙肝及肝癌患者的外周血白細(xì)胞（包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）內(nèi)存在HBV DNA，并發(fā)現(xiàn)其存在形式分為整合型和游離型兩種。由于白細(xì)胞對(duì)機(jī)體的免疫功能起著重要的作用，而在多數(shù)乙肝患者中又常出現(xiàn)免疫功能紊亂的表現(xiàn)，因此以上發(fā)現(xiàn)不但證明了白細(xì)胞能夠被 HBV 感染，而且提示這可能是致使乙肝患者免疫功能紊亂的原因之一。HBV cccDNA 被認(rèn)為是 HBV復(fù)制的模板，如果 HBV cccDNA 檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，通常認(rèn)為存在HBV的復(fù)制。近年來國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道 PBMC 可被HBV 感染，并且 HBV 可以在PBMC 中復(fù)制[3-6]。劉先進(jìn)等[7]研究證實(shí)外周血白細(xì)胞中存在HBV cccDNA，并且慢性肝病患者外周血 HBV cccDNA 與血清 HBV DNA 含量存在一定關(guān)聯(lián)。

2 HBV 存在于PBMC的意義

2.1 闡明 HBV的致病機(jī)制

目前的研究表明，HBV 感染的主要發(fā)病機(jī)制是病毒感染所致的免疫病理應(yīng)答。免疫功能紊亂的現(xiàn)象常常存在于慢性 HBV 感染者[8]。PBMC 在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)中起重要作用。感染 HBV的PBMC 與患者體內(nèi)的免疫功能紊亂是否存在相關(guān)性，已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究報(bào)道PBMC 免疫功能紊亂與HBV的復(fù)制有明顯關(guān)系，HBV 感染可能影響 PBMC 產(chǎn)生 IFN-γ的能力[9-10]。鐘艷丹等[11]的研究結(jié)果初步說明 HBV 直接感染 PBMC 后，能使免疫細(xì)胞的功能改變，它可能是引起 HBV 感染后機(jī)體抗 HBV免疫功能低下、Th1/Th2 失衡，形成慢性乙型肝炎的發(fā)病機(jī)制之一。還有報(bào)道認(rèn)為HBV 感染的PBMC 與HBV 隱性感染[12]及肝移植后HBV 再感染[13]有關(guān)。HBV 感染PBMC 對(duì)機(jī)體免疫功能的影響正越來越多地受到關(guān)注。

2.2 闡明 HBV的傳播途徑

大量研究表明，胎兒 PBMC 中 HBV 感染率與母親、胎兒的病毒血癥水平及母親 PBMC 中 HBV DNA 狀態(tài)有關(guān)[14]，提示我們 PBMC 中的HBV DNA 可能是 HBV 母嬰垂直傳播的一條重要途徑。有研究者認(rèn)為HBV 可能通過2 種途徑感染胎兒 PBMC：一種是因?yàn)镻BMC 有變形游走性，可在組織間隙自由移動(dòng)，所以母親陽(yáng)性 PBMC 通過游走進(jìn)入胎兒體內(nèi)；一種是母血 HBV 經(jīng)胎盤感染或滲漏進(jìn)入胎兒體內(nèi)，感染胎兒 PBMC 或通過感染胎兒骨髓干細(xì)胞、胸腺后，釋放 HBV 感染的PBMC[15]。

黃敦武等[16]運(yùn)用 PCR 法在慢性乙型肝炎患者 PBMC中檢測(cè)出HBV DNA，并且還可以在中性粒細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞和非 T 淋巴細(xì)胞中檢測(cè)出HBV DNA。從而推斷，體液中含有白細(xì)胞，而帶有 HBV的白細(xì)胞就成為傳播的媒介。

2.3 監(jiān)測(cè) HBV 患者病情的可能指標(biāo)之一

一般認(rèn)為血清中 HBeAg 與HBV DNA是病毒復(fù)制的檢測(cè)指標(biāo)，后者通常在HBeAg 陰轉(zhuǎn)時(shí)消失。李秀梅等[17]研究表明，血清中 HBV DNA(–) 并不完全意味著病毒的清除與復(fù)制水平降低或消失，并且有 PBMC 感染 HBV 者可出現(xiàn)血清 HBV 重新復(fù)制及致使肝功能再度受損的危險(xiǎn)。有學(xué)者認(rèn)為PBMC 可以作為HBV 肝外復(fù)制的場(chǎng)所和病毒的儲(chǔ)存庫(kù)，從中可以檢出RNA 復(fù)制中間體、HBV 整合形式甚至 cccDNA[18]。很多研究證明血清 HBV cccDNA 可能不只是來源于肝組織。PBMC 中的HBV cccDNA 在一定程度上可代替肝組織 HBV cccDNA 用于檢測(cè)、判斷病毒復(fù)制。PBMC 中 HBV cccDNA、血清 HBV DNA 兩者聯(lián)合檢測(cè)更能準(zhǔn)確判斷 HBV 復(fù)制率[19-20]，可以了解肝外組織或細(xì)胞是否存在HBV。

2.4 研究 HBV DNA的細(xì)胞模型

HBV 可以直接感染 PBMC，HBV DNA 可以在PBMC內(nèi)復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，HBV DNA 還可以整合到宿主 PBMC的基因組內(nèi)。有研究表明在HBV DNA 轉(zhuǎn)染 PBMC 成功后，細(xì)胞可產(chǎn)生全部病毒標(biāo)志物、復(fù)制中間體、轉(zhuǎn)錄體及22 nm球形 HBsAg 顆粒。邢益平等[21]構(gòu)建了乙型肝炎患者外周血 PBMC 體外培養(yǎng)體系，并且在該細(xì)胞系的上清液和培養(yǎng)細(xì)胞中均檢測(cè)出HBV DNA。該研究提示培養(yǎng)細(xì)胞中有HBV 復(fù)制，且能將病毒分泌到上清液中，這表明該培養(yǎng)系統(tǒng)基本代表了 HBV 在體內(nèi)感染、復(fù)制和分泌的全過程。陳豐哲[22]研究報(bào)道了 HBV 核心蛋白及X蛋白可以在長(zhǎng)期培養(yǎng)的PBMC 中穩(wěn)定表達(dá)，這也表明 PBMC 可以作為HBV 體外表達(dá)的細(xì)胞模型。

另有資料表明，PBMC 中的不同亞群都可以感染HBV，感染率由高至低依次為：?jiǎn)魏思?xì)胞、B 淋巴細(xì)胞、CD8+T 淋巴細(xì)胞、NK 細(xì)胞和CD4+T 淋巴細(xì)胞[23]。目前，國(guó)內(nèi)很多學(xué)者都用永生化 B 淋巴母細(xì)胞作為宿主細(xì)胞構(gòu)建 HBV的真核表達(dá)體系。例如，張明霞等[24]研究建立了慢性乙型肝炎患者永生化的B 淋巴母細(xì)胞系，并且穩(wěn)定表達(dá)了 HBV 全基因 c 區(qū)突變株，為體外研究 HBV 特異性免疫應(yīng)答提供了刺激細(xì)胞和靶細(xì)胞。

3 PBMC 中 HBV DNA的常用檢測(cè)技術(shù)

以往大多文獻(xiàn)報(bào)道常用于檢測(cè)乙肝患者 PBMC 中HBV cccDNA的方法是蛋白免疫印跡法（southern blot），該方法是分子生物學(xué)的經(jīng)典方法，其檢測(cè)結(jié)果較為準(zhǔn)確，但是存在敏感性偏低且不能準(zhǔn)確定量，操作比較繁瑣，所需標(biāo)本量較大等缺點(diǎn)。相反，聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)具有敏感、快速、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛用于HBV DNA的相關(guān)檢測(cè)與研究中。目前國(guó)內(nèi)外針對(duì) PBMC 中 HBV DNA 常用的檢測(cè)方法還有：熒光定量 PCR 技術(shù)、PCR-微流芯片技術(shù)等。

3.1 熒光定量 PCR 技術(shù)

熒光定量 PCR 技術(shù)是指在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè) PCR 進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法[25-26]。其融合PCR和熒光探針雜交技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，直接探測(cè) PCR 過程中熒光信號(hào)的變化，根據(jù) PCR 反應(yīng)的酶動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，獲得DNA 模板的準(zhǔn)確定量結(jié)果。該技術(shù)便于研究者實(shí)時(shí)觀測(cè)PBMC 中 HBV DNA的含量。

3.2 PCR-微流芯片技術(shù)

PCR-微流芯片技術(shù)是一種新型芯片檢測(cè)方法，結(jié)合凝膠電泳分離熒光檢測(cè)，具有較高靈敏度和實(shí)用性。其通過熒光檢測(cè)識(shí)別不同大小的DNA 片段，并以數(shù)字化形式輸出PCR 產(chǎn)物大小等信息，這些圖形直觀，結(jié)果易判斷，除用于研究外，還可用于獻(xiàn)血者的定性篩查等。該方法同時(shí)設(shè)有內(nèi)對(duì)照體系，與靶基因在同一系統(tǒng)進(jìn)行提取、擴(kuò)增和檢測(cè)，可以有效監(jiān)測(cè)整個(gè)體系，防止假陰性產(chǎn)生，HBV DNA 檢測(cè)靈敏度和重復(fù)性可達(dá)到較高水平，相比其他同類方法，具有較大的應(yīng)用推廣價(jià)值[27]。

4 展望

綜上所述，PBMC 可被 HBV 感染，并且 HBV 可以在PBMC 中復(fù)制。PBMC 包括多種免疫細(xì)胞，對(duì)機(jī)體的免疫功能起重要作用，感染 HBV的PBMC 功能如何改變，對(duì)機(jī)體的免疫反應(yīng)產(chǎn)生何種影響是目前的研究熱點(diǎn)也是研究難點(diǎn)。研究 PBMC 內(nèi)感染 HBV 有助于闡明 HBV的致病機(jī)制，了解 HBV 在體內(nèi)的傳播途徑，并為HBV 患者的病情診斷提供更充足的依據(jù)，為乙肝患者的治療提供新的思路和方法。同時(shí)，關(guān)于感染 HBV的PBMC 還有很多問題需要我們進(jìn)行大量的研究來解釋。其中，PBMC是否為除肝組織以外的HBV的另一個(gè)復(fù)制場(chǎng)所和病毒儲(chǔ)存庫(kù)，目前尚未有明確定論；慢性乙型肝炎患者出現(xiàn)的免疫功能低下和紊亂是否與HBV 直接感染免疫細(xì)胞有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究；PBMC 感染 HBV 后細(xì)胞因子的分泌水平如何發(fā)生變化及其改變機(jī)制，也需要更多的研究從而闡明。

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