丁浩，張文健，溫見燕，葉志東，莊乾淑，李建中，婁晉寧，劉鵬

糖尿病是嚴重損害我國人口健康的主要疾病之一，糖代謝紊亂所引發(fā)的血管病變是導致糖尿病患者致殘和致死的主要原因。如何防治糖尿病血管病變所產(chǎn)生的并發(fā)癥是糖尿病研究的熱點課題。糖尿病足是糖尿病患者由于神經(jīng)或血管病變導致足部缺血性壞死并合并感染的一種嚴重并發(fā)癥。由于對其發(fā)生機制不完全明了，目前臨床缺乏特異有效的治療手段。近年來，自體干細胞移植成為治療糖尿病足的一種新方法，但由于技術不成熟，機制不明了，療效不確切，目前尚處于探索階段。血管內皮前體細胞（endothelial progenitor cell，EPC）具有自我更新和定向分化成為血管內皮細胞的潛能，具有修復內皮細胞損傷、促進血管新生的能力，因此EPC 移植未來可能成為治療糖尿病足的一種新方法。本文就這方面的研究進展作一扼要的綜述。

1 糖尿病足的發(fā)生機制及傳統(tǒng)治療方法

隨著人民生活水平的不斷提高，糖尿病的發(fā)病率逐漸上升，我國糖尿病患者已經(jīng)達到 9200萬，而且還在以每年120萬人的速率增加[1]。糖尿病產(chǎn)生糖代謝紊亂導致血管病變引發(fā)的一系列并發(fā)癥包括視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病和糖尿病足?！疤悄虿∽恪钡母拍钣?Catterall等[2]于1956年首次提出，1972年將其定義為因神經(jīng)病變而失去感覺和因缺血而失去活力，合并感染的足[3]。糖尿病足一般分為三種類型，即神經(jīng)型、缺血型和神經(jīng)-缺血混合型。在我國，糖尿病足以混合型為主，其次為缺血型，而單純神經(jīng)型比較少見[4]。

傳統(tǒng)的觀點認為：糖尿病血管病變的病理基礎主要是動脈粥樣硬化[5]。形成糖尿病足的根本原因是下肢動脈粥樣硬化引起的慢性血管閉塞，導致下肢遠端組織缺血壞死。動脈粥樣硬化是發(fā)生在大血管的一種病變，以血管內皮細胞損傷，血管壁脂質沉積和平滑肌細胞增殖為主要病理改變。輕度血管閉塞者表現(xiàn)細胞變性，出現(xiàn)間歇性跛行、疼痛等癥狀；重度血管閉塞者導致組織細胞壞死，出現(xiàn)下肢遠端組織潰瘍或壞疽。有證據(jù)表明，糖尿病足的最終結局是：潰瘍-截肢-死亡，并且早期篩查和有效治療是影響預后的重要因素[6-10]。然而，除大血管病變外，糖尿病足患者也存在微血管的病變，表現(xiàn)為微血管舒縮功能障礙，凝血和纖溶活性的改變以及血管新生能力的降低[11-13]，導致病變血管遠端的缺血區(qū)不能建立有效的側支循環(huán)。

糖尿病足的傳統(tǒng)治療主要是內科的藥物治療和外科的下肢遠端血流重建和截肢。藥物治療主要用于糖尿病足病變的早期和輕度患者。對于因動脈閉塞性病變導致的足部缺血需行外科處理，多采用血流重建手術以挽救缺血肢體，避免截肢或盡量降低截肢平面。但由于此類患者多年老體弱，并常伴有心腦血管病變，無法承受手術搭橋等刺激；另外，此類患者的下肢病變多累及小腿動脈，經(jīng)常有部分患者缺乏遠端動脈流出道，這些患者由于無法接受動脈搭橋或血管介入治療而經(jīng)常面臨截肢的危險。

近年來有關干細胞的基礎研究和臨床實踐為糖尿病足的治療帶來新的思路。干細胞移植治療糖尿病足是最近幾年剛剛開展的一項新技術，盡管還有很多尚未解決的問題，但這一技術業(yè)已展現(xiàn)出美好的應用前景。

2 自體干細胞移植治療糖尿病足的臨床應用

目前，臨床干細胞移植治療下肢血管病變有兩種方法：自體骨髓干細胞移植和自體外周血干細胞移植。用于干細胞移植治療的骨髓干細胞包括以下幾種：骨髓單個核細胞（bone marrow-derived mononuclear cell，BMNC）、骨髓間充質干細胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BMSC）和造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSC）。2002年日本學者 Tateishi-Yuyama等[14]在國際首次報道了應用患者自體骨髓干細胞移植治療缺血性下肢血管疾病，取得了滿意療效，未發(fā)現(xiàn)不良反應，這也是首次在此領域進行的臨床研究。試驗最終納入 45 例患者，其中 23 例單側下肢缺血患者接受 BMNC 移植，對側肢體注射生理鹽水作為對照，另外 22 例雙下肢缺血患者的兩肢體分別接受 BMNC移植和外周血單個核細胞移植。采用踝肱指數(shù)（ABI）、經(jīng)皮氧分壓、靜息痛、無痛行走時間、缺血性潰瘍的改善及動脈造影作為評價指標，結果表明注射BMNC的肢體上述指標均有明顯的改善。

2003年谷涌泉等[15-16]在國內首先開展了自體骨髓干細胞移植治療糖尿病足的臨床研究，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)患者在治療后達到了避免截肢或降低截肢平面的目的。Procházka等[17]報道，采用自體 BMNC 移植能改善糖尿病足肢體的缺血狀況。從國內外臨床應用情況來看，均達到了緩解癥狀、降低截肢平面甚至避免截肢的效果。

由于骨髓采集需硬膜外麻醉或全身麻醉，對患者的全身情況要求高，而且采髓量較大（最多需 500ml），使部分患者在心理上難以接受。近年來開展了自體外周血干細胞移植的研究，這種方法操作簡單，患者易于接受。中國醫(yī)學科學院天津血液病研究所黃平平等[18]報道，對一名確診嚴重下肢動脈硬化性閉塞癥患者，應用重組人粒細胞集落刺激因子（G-CSF）進行外周血干細胞動員 5d后，用血細胞分離機采集干細胞并配成細胞混懸液，按 3cm×3cm間距肌肉注射進行雙下肢移植，44 d 后給病情較重的左下肢第二次移植相同的細胞數(shù)。細胞移植一個月后末梢血流波幅和激光多普勒掃描血流灌注量較移植前顯著改善，數(shù)字減影下肢動脈造影結果顯示新側支血管形成明顯增加；細胞移植 3個月后，患者疼痛、患肢冷感、間歇性跛行、潰瘍明顯好轉，左、右足踝肱指數(shù)（ABI）分別由 0.49、0.69 上升為0.50、0.85。

自體外周血干細胞移植同骨髓干細胞移植相比，具有采集的干細胞數(shù)量多、無抽髓的痛苦等優(yōu)點，患者易于接受，尤其適合高齡、合并癥多或不愿抽髓的患者，但是存在血液高凝和血栓形成的風險。

從理論上講，干細胞中對糖尿病足具有治療作用的細胞主要是 EPC。然而，EPC 在外周血干細胞中的含量不足1%，而在BMNC中的EPC 含量約占 3%。由于EPC 細胞含量非常有限，因此采用自體 BMNC 移植和外周血干細胞移植治療糖尿病足的療效也是有限的。當前，自體干細胞治療糖尿病足的主要問題是：①機制不明了。雖然部分患者在接受自體干細胞治療后糖尿病足的病情獲得了改善，但是產(chǎn)生這種改善的機制并不清楚。由于在自體干細胞中，EPC細胞的含量是很少的，這部分細胞的治療作用是很有限的，是否存在自體干細胞移植后分化成為EPC 細胞還缺乏實驗證據(jù)；②技術不規(guī)范，療效不確切。對采集的干細胞缺乏質量和數(shù)量的標準；干細胞移植的方法也不規(guī)范，包括：靜脈輸入，通過介入方法定向移植到糖尿病患者下肢動脈，局部注射到糖尿病足缺血區(qū)。由于對移植的干細胞缺乏標準，細胞移植的方法不一致，因此很難對療效進行科學的評價。

3 EPC的研究進展

機體在缺血時會代償生成新生血管。這種血管新生有兩種方式：血管生成（angiogenesis）和血管發(fā)生（vasculogenesis）。前者是指通過血管內皮細胞遷移、增殖，在原有的血管上以出芽的方式生長出新的血管；后者是指在原來沒有血管系統(tǒng)的情況下，通過血管內皮前體細胞和造血干細胞的分化和相互作用產(chǎn)生新的血管[19-20]。傳統(tǒng)觀念認為機體出生后，循環(huán)系統(tǒng)已完全形成，因此認為由 EPC 再進一步分化成血管內皮細胞形成血管系統(tǒng)的過程不再存在，直到 1997年，Asahara等[21]從新生兒的外周血中分離并證實血液循環(huán)中存在EPC，這一觀點才發(fā)生改變。

研究發(fā)現(xiàn)，人外周血 CD34+和VEGFR2+ 細胞在體外能夠增殖轉化為血管內皮細胞，因此認為：骨髓來源的表達 CD133+、VEGFR2+、CD34+的細胞具有分化為內皮樣細胞的功能，并將這些細胞定義為EPC[22]。這些細胞分化時，CD133 逐漸轉為陰性，而 CD31、血管性血友病因子（VWF）、血管內皮的鈣黏蛋白等表達逐漸增多，形成成熟的內皮細胞[23]。目前認為：EPC 不僅參與人胚胎血管生成，也參與出生后的血管新生過程及機體、器官損傷后的血管再生與修復。

“治療性血管生成”的概念是指將外源性促血管生成因子和（或）成血管細胞導入缺血組織內，促進其血管新生和側支血管形成（包括血管生成和血管發(fā)生），以改善局部血流供應，達到治療缺血性疾病的目的。外周循環(huán)的成熟EPC 具有趨化、黏附、遷移和整合等作用，它們能黏附到損傷的內皮細胞，并進一步分化為成熟內皮細胞[24]。Griese等[25]報道，在球囊導致的頸總動脈內皮細胞損傷動物模型上給予自身的EPC 后的第 4 天，就可發(fā)現(xiàn)這些細胞內襯于損傷的頸總動脈內皮層，其內皮修復率達 60%。He等[26]證實，在注射 EPC 四周后，可明顯改善去內皮頸總動脈對乙酰膽堿的舒血管反應，血管舒張功能增強，表明移植的EPC 細胞在去內皮的主動脈發(fā)揮了生理調節(jié)功能。在小鼠后肢缺血模型也證實，注射 EPC能促進局部的血管新生并改善缺血組織的血液供應[27]。Kalka等[28]將人 EPC 移植給無胸腺裸鼠的缺血后肢 28 d 后，缺血后肢的血流量恢復至手術前的70%，而輸注等量人微血管內皮細胞培養(yǎng)液或EPC 培養(yǎng)液的對照組分別只恢復到 27%和34%；在EPC治療組，10/17 動物的后肢恢復了功能，而對照組的動物后肢功能恢復率僅分別為1/14和1/12；病理組織切片證實，人 EPC 參與了缺血區(qū)新生血管的形成。

EPC 不僅可以通過促進血管新生改善局部的血液供應，還可以通過分泌某些細胞因子營養(yǎng)末梢神經(jīng)改善糖尿病足的周圍神經(jīng)病變和周圍血管病變。骨髓來源的EPC 在糖尿病神經(jīng)病變中具有血管再生和神經(jīng)營養(yǎng)雙重作用。研究表明，在許多神經(jīng)病變中，血管功能的缺陷起到關鍵性作用[29]。許多經(jīng)典的促血管生成因子，如血管內皮生長因子（VEGF）也具有神經(jīng)營養(yǎng)作用；而許多神經(jīng)營養(yǎng)因子，如神經(jīng)生長因子（NGF）也具有血管再生作用。在鏈脲菌素誘導的糖尿病鼠模型上，坐骨神經(jīng)的運動和感覺神經(jīng)傳導速度、血流和毛細血管密度都減小了，但在后肢注射骨髓來源的EPC 后，在EPC 注射的神經(jīng)部位，多種血管再生因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子都顯著增加，并且運動和感覺神經(jīng)傳導速度、血流和毛細血管密度都恢復到正常水平，證實骨髓來源的EPC能夠改善糖尿病的神經(jīng)病變[30]。通過在糖尿病神經(jīng)病變部位特別是神經(jīng)滋養(yǎng)血管預先和長期植入 EPC的促進血管新生和旁分泌作用，能夠提高治療效果。這些發(fā)現(xiàn)表明，EPC 移植是治療糖尿病神經(jīng)病變和血管病變的一種新方法。

生理狀態(tài)下，機體外周血中 EPC 數(shù)量很少，約為2～3個/ml，在某些生理或病理情況下 EPC 可被動員入血發(fā)揮功能。有研究顯示體育鍛煉、粒細胞集落刺激因子（G-CSF）、促紅細胞生成素（EPO）、雌激素、血管內皮生長因子（VEGF）等都能增加外周循環(huán)中的EPC 數(shù)量[31-35]。但在高齡、糖尿病和動脈粥樣硬化等病理狀態(tài)下，EPC 數(shù)量和功能都明顯降低[36]，并且 EPC 特異分子如胎肝激酶（Flk-1）、CD133和鈣黏蛋白（cadherin）的mRNA 水平明顯低于健康對照組[37]。有報道，糖尿病患者體內 EPC 活性降低，并且直接與活性氧族生成增加有關，血循環(huán)中 EPC黏附和遷移能力下降[38]。類似的情況也發(fā)生在肥胖和代謝綜合征患者中，說明此類患者自發(fā)的血管新生的潛能降低，這為自體干細胞移植提供了一定的理論依據(jù)。

4 EPC 治療糖尿病足的前景

EPC 移植技術的出現(xiàn)，使其有可能作為未來治療糖尿病足的一種有效方法。首先，EPC 移植可以修復動脈粥樣硬化血管擴張后內皮細胞損傷，防止擴張后再狹窄的發(fā)生；其次，EPC 移植可以促進缺血區(qū)新生血管的生成，促進側支循環(huán)的建立。因此，從理論上講 EPC 移植治療糖尿病足應該獲得更好的臨床療效。盡管 EPC 治療糖尿病足可能具有美好的應用前景，但還有若干技術問題有待解決：

⑴大量高純度的EPC的獲得

無論自體骨髓干細胞，還是自體外周血干細胞，EPC的含量都是很少的。提高 EPC的第一種方法是體外應用定向誘導分化技術將人的胚胎干細胞轉化成為EPC，但目前還沒有找到能夠高效定向誘導制備 EPC的方案，并且異體干細胞治療的安全性還有待評價。第二種方法是先分離純化自體骨髓或外周血中的EPC，然后通過體外擴增技術大量制備 EPC。此方法的關鍵是 EPC的擴增技術。由于用來移植的細胞在體外擴增時不能使用胎牛血清等動物血清，有研究者嘗試使用自體血清進行培養(yǎng)。結果發(fā)現(xiàn)可以達到與用胎牛血清培養(yǎng)基本相同的效果，且安全性更高，因此更適合應用于臨床治療[39]。另外，最近還發(fā)現(xiàn)一種新型生物多聚體chitosan-phosphorylcholine（CH-PC）能夠增加 EPC的存活率，并促進其黏附和擴增[40]。盡管不斷有新的方法，但體外擴增技術仍比較復雜，并且體外的長期培養(yǎng)增加細胞被污染的可能性，增加治療的不安全性。第三種方法是應用干細胞技術制備 EPC：由于自體干細胞中 EPC的數(shù)量非常有限，因此應用 iPS 細胞體外定向分化為EPC 可能成為未來一種可行的策略。有研究顯示，應用與人胚胎干細胞定向分化為EPC 相同的方法，iPS 細胞也能定向分化為EPC，且這兩種來源的EPC的性質幾乎一致，但 iPS 細胞誘導分化的EPC 在體內的功能還未得到評價[41-42]?？傊瑹o論采用什么方法，都需要解決干細胞的體外擴增和定向誘導分化兩個技術難題。

⑵細胞移植方式

采用 EPC 細胞治療糖尿病足主要基于兩個方面的作用：①利用 EPC 修復下肢病變血管的內皮細胞損傷；②利用 EPC 在缺血區(qū)局部形成新生血管，建立有效的側支循環(huán)，改善血液供應。因此，細胞的移植方式可能直接影響治療的療效。前者適宜采用動脈介入的方式將 EPC 植入病變的血管，并局部停留一定的時間；而后者多采用缺血區(qū)局部注射的方式為佳。通過靜脈輸入的方式容易使 EPC 滯留在肺循環(huán)而影響治療效果。

⑶建立科學規(guī)范的療效評價體系

雖然自體干細胞治療糖尿病足已經(jīng)開始了臨床試驗研究，但必須明確這項技術還處于臨床試驗階段，還不能作為臨床糖尿病足的常規(guī)治療手段，其有效性和安全性還有待臨床的檢驗。因此，建立科學規(guī)范的療效評價體系非常重要，其中包括：必要的臨床前研究基礎；臨床試驗單位資質的取得；醫(yī)學倫理委員會的審批；科學的對照體系和系統(tǒng)全面的評價指標。

EPC 治療性血管修復或血管生成技術已向人們展示出對糖尿病足的應用前景，雖然還有許多技術問題尚需解決，但這種方法較傳統(tǒng)的治療方法具有無可比擬的優(yōu)越性。隨著干細胞基礎與臨床應用研究的不斷深入，相信在不久的將來，采用干細胞技術制備的EPC 移植治療糖尿病足的應用研究一定會取得突破。

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