李書芬，武臨專，陳菲菲,2，王紅遠，孫桂芝，王以光

1 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)藥生物技術(shù)研究所 衛(wèi)生部抗生素生物工程重點實驗室，北京 100050

2 中國醫(yī)藥集團四川抗菌素工業(yè)研究所，成都 610052

在對格爾德霉素 (Geldanamycin，GDM；一種苯醌型安莎類抗生素) 產(chǎn)生菌吸水鏈霉菌Streptomyces hygroscopicus 17997的次級代謝產(chǎn)物進行研究時，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵上清液具有抗革蘭陽性菌活性[1]。格爾德霉素具有抗真菌活性，但不具有抗革蘭陽性菌活性。萘安莎類抗生素如利福霉素(Rifamycin)、萘霉素 (Naphthomycin) 和紅迪菌素(Rubradirin) 等，具有顯著的抗革蘭陽性菌活性。在吸水鏈霉菌17997的基因組DNA中存在可能負責萘安莎類抗生素生物合成的基因[1-3]，因而曾經(jīng)推測該菌株具有萘安莎類抗生素產(chǎn)生潛能，但是該推測始終沒有得到證實。

本研究對吸水鏈霉菌 17997產(chǎn)生的一個具有抗革蘭陽性菌活性化合物進行了快速鑒定，確證為洋橄欖葉素 (Elaiophylin；又稱阿沙霉素B，azalomycin B；化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1)，具體報道如下。

圖1 洋橄欖葉素化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structure of elaiophylin.

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：吸水鏈霉菌17997，GDM產(chǎn)生菌；枯草芽胞桿菌 63501，革蘭陽性檢定菌；上述菌株均為本實驗室保藏。

培養(yǎng)基：ISP2培養(yǎng)基：酵母提取物0.4%，麥芽提取物1.0%，葡萄糖0.4%，瓊脂粉1.8%。液體發(fā)酵培養(yǎng)基：淀粉2%，棉子餅粉0.5%，葡萄糖0.5%，玉米漿1.0%，酵母粉0.5%，CaCO30.2%。生物檢定培養(yǎng)基：蛋白胨0.6%，牛肉膏0.3%，酵母膏0.3%，葡萄糖0.1%，瓊脂1.2%，pH 7.2。

試劑：酵母提取物 (Yeast extract)、麥芽提取物 (Malt extract)，英國Oxoid公司產(chǎn)品，葡萄糖為國產(chǎn)分析純試劑。TLC硅膠板 (GF254)，山東煙臺吉德精細化工有限公司或青島海洋化工分廠產(chǎn)品。乙酸乙酯 (EtOAc)、甲醇、二氯甲烷、環(huán)己烷等有機溶劑為北京化工廠分析純試劑。洋橄欖葉素對照品由中國科學(xué)院成都生物研究所李國友博士惠贈[4]，以及澳大利亞 Bioaustralis 公司產(chǎn)品。PCR引物及相關(guān)試劑由寶生物工程 (大連) 有限公司合成或提供。

1.2 方法

吸水鏈霉菌 17997的培養(yǎng)與發(fā)酵：新鮮的吸水鏈霉菌 17997孢子斜面 (ISP2培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)7~10 d，挖塊接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃振蕩(200 r/min) 培養(yǎng)48~96 h。發(fā)酵液離心后，棄沉淀；發(fā)酵上清液用于乙酸乙酯 (EtOAc) 提取分析等。

EtOAc提?。喝∥溍咕?7997發(fā)酵上清液25 mL，用等體積EtOAc萃取，傾出EtOAc萃取液，室溫吹干，復(fù)溶于約0.5 mL EtOAc中。

硅膠板TLC分離檢測以及NaOH顯色：取上述20 μL EtOAc提取物濃縮液，硅膠板TLC初步分離，在EtOAc∶二氯甲烷∶正己烷∶甲醇 (9∶6∶6∶2，V/V/V/V) 溶媒系統(tǒng)中展開后，用2.0 mol/L NaOH溶液噴涂 (一種針對格爾德霉素及其生物合成類似物的顯色方法[5])，照相記錄。

抗革蘭陽性菌活性檢測：將上述 TLC硅膠板(沒有用NaOH溶液噴涂顯色) 貼到含枯草芽胞桿菌63501的生物檢定培養(yǎng)基平板上約1 min，揭去硅膠板，將平板置于37 ℃培養(yǎng)16 h，平板上透明帶對應(yīng)的硅膠板條帶含有抗革蘭陽性菌活性化合物。

HPLC和LC-MS：將硅膠板上含有抗菌活性化合物的條帶用EtOAc洗脫下來后，吹干，復(fù)溶于少量甲醇中，進行HPLC和LC-MS分析。HPLC分析：Dikma Diamonsil C18反相色譜柱，(5 μm，150 mm× 4.6 mm)；20%~100%甲醇梯度洗脫，30 min；流速1 mL/min；檢測波長256 nm。LC-MS分析：Agilent 1200液相色譜系統(tǒng)與 Applied Biosystems/MSD SCIEX (Concord，Ont，Canada) 公司的Qstar LC-MS質(zhì)譜儀聯(lián)用，配有Turbo Ionspray離子化源。液相色譜條件同HPLC。質(zhì)譜檢測條件：噴霧電壓5.5 kV；溫度450 ℃；解簇電壓80 V；霧化氣40相對單位，輔助氣30相對單位，均為氮氣；全掃描監(jiān)測，正離子方式，質(zhì)荷比 (m/z) 范圍為 100~1 300；采用信息依賴掃描模式獲得二級質(zhì)譜；碰撞壓力設(shè)為高；碰撞能量為50eV。

dTDP-葡萄糖-4,6-脫水酶基因保守區(qū)的 PCR擴增：上游引物P1序列5′-GSGGSGSSGCSGGSTTC ATSGG-3′，下游引物P2序列5′-GGGWRCTGGYRS GGSCCGTAGTTG-3′[6]；其中，R=A/G，W=A/T，Y=C/T，S=C/G。吸水鏈霉菌17997總DNA (PCR模板) 提取，微波法[7]；使用寶生物工程 (大連) 有限公司Taq LA聚合酶、GC Buffer I進行PCR，PCR主要參數(shù)為：96 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗菌活性化合物的HPLC分析

在對吸水鏈霉菌 17997次級代謝產(chǎn)物分析時，發(fā)現(xiàn)一條在TLC硅膠板上用NaOH溶液噴涂顯紅色的條帶 (圖 2)?？咕钚苑治鲲@示：該紅色條帶所對應(yīng)的化合物 (未顯色) 具有抗革蘭陽性菌活性。將該條帶所含化合物從硅膠板上洗脫下來后進行HPLC分析，出現(xiàn)一個顯著的洗脫峰，其紫外吸收峰形與保留時間均與文獻報道的洋橄欖葉素基本一致[8-9]。有報道在格爾德霉素產(chǎn)生菌的次級代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)洋橄欖葉素[9-10]。

圖2 吸水鏈霉菌 17997發(fā)酵液乙酸乙酯提取物經(jīng) TLC硅膠板分離后用2.0 mol/L NaOH溶液噴涂顯色結(jié)果Fig. 2 Color reaction by spraying 2.0 mol/L NaOH onto the TLC silica gel of EtOAc extract of the fermentation supernatant of Streptomyces hygroscopicus 17997.

圖3 吸水鏈霉菌17997所產(chǎn)生的抗革蘭陽性菌活性化合物的HPLC譜圖Fig. 3 HPLC profile of the compound with anti-Gram positive bacteria activity from Streptomyces hygroscopicus 17997.

對吸水鏈霉菌17997菌絲體用丙酮浸泡提取和分析后，發(fā)現(xiàn)更多的NaOH溶液噴涂顯紅色化合物，這與洋橄欖葉素作為次級代謝產(chǎn)物主要存在于菌絲體內(nèi)的報道相符合[11]。將該化合物與洋橄欖葉素對照品混和后進行HPLC分析，二者的保留時間和紫外吸收峰形一致；洋橄欖葉素對照品在TLC硅膠板上用NaOH溶液噴涂顯示相同的紅色。因此，該化合物很可能是洋橄欖葉素。

2.2 吸水鏈霉菌17997基因組DNA含有洋橄欖葉素dTDP-葡萄糖-4,6-脫水酶 (Tgd) 基因

洋橄欖葉素化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有 2-脫氧-L-巖藻糖(2-deoxy-L-fucose) 組分。已知葡萄糖通過磷酸化、dTDP化、脫水、還原、差向異構(gòu)化等反應(yīng)生成 2-脫氧-L-巖藻糖，再經(jīng)糖基轉(zhuǎn)移酶催化進入到洋橄欖葉素分子中；2-脫氧-L-巖藻糖的生物合成需要Tgd[12]。采用tgd基因保守區(qū)設(shè)計的引物，以吸水鏈霉菌17997基因組DNA為模板，PCR得到一條預(yù)計大小 (約0.6 kb) 的特異性DNA條帶 (圖4)。對該 DNA條帶進行測序 (GenBank Accession No. HQ260658)，它所編碼的氨基酸序列，與美國專利US 7595187報道的洋橄欖葉素生物合成基因簇中dTDP-葡萄糖-4,6-脫水酶基因 (EMBL Accession No. GP697132) 保守區(qū)編碼氨基酸序列幾乎完全相同 (Identities=154/158 (97%)，Positives=156/158 (98%)，Gaps=1/158 (0%))[13]，從而確證PCR擴增的 DNA片段屬于洋橄欖葉素生物合成基因簇中的tgd基因保守區(qū)。吸水鏈霉菌17997中存在洋橄欖葉素tgd基因，提示其具有產(chǎn)生洋橄欖葉素的遺傳基礎(chǔ)。

2.3 抗菌活性化合物與洋橄欖葉素具有相同的LC-MS譜

圖4 PCR擴增吸水鏈霉菌17997中的tgd保守區(qū)Fig. 4 PCR amplification of the conserved region of tgd from Streptomyces hygroscopicus 17997. 1: DNA marker; 2: the conserved region of tgd (600 bp) from Streptomyces hygroscopicus 17997.

圖5 吸水鏈霉菌17997中產(chǎn)生的抗菌活性化合物的二級MS譜圖Fig. 5 The MS2 profile of the compound with antibacterial activity from Streptomyces hygroscopicus 17997.

為了確證吸水鏈霉菌 17997中的抗革蘭陽性菌活性化合物為洋橄欖葉素，對其進行了LC-(+)-ESIMS分析 (圖5)：MS1顯示一個m/z=1 047.7的加合離子 ([M+Na]＋)，其MS2主要碎片離子為m/z=729.4和 411.2。已知洋橄欖葉素的分子式為 C54H88O18，精確分子質(zhì)量 1 024.60。該化合物與文獻所述的洋橄欖葉素MS1和MS2結(jié)果一致[14]。其中，m/z=729.4碎片離子系分子丟失兩個 2-脫氧-L-巖藻糖組分形成，m/z=411.2碎片離子系分子的內(nèi)酯環(huán)組分進一步脫水形成。因此，該抗菌活性化合物被證實為洋橄欖葉素。

3 討論

吸水鏈霉菌是鏈霉菌屬中的一個比較常見種。據(jù)不完全統(tǒng)計，吸水鏈霉菌能夠產(chǎn)生100多種不同的次級代謝產(chǎn)物；此外，同一菌株產(chǎn)生一種以上不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的抗生素并不少見。洋橄欖葉素是一種大環(huán)二內(nèi)酯類抗生素，在雷帕霉素 (Rapamycin)、尼日利亞菌素 (Nigericin) 和除莠霉素 (Herbimycin) 等抗生素產(chǎn)生菌 (屬于吸水鏈霉菌) 的次級代謝產(chǎn)物中均發(fā)現(xiàn)了洋橄欖葉素[15-16]。

近年來，對微生物次級代謝產(chǎn)物、特別是抗生素的生物合成機制有了越來越多的研究和認識，并積累了大量的抗生素生物合成基因 (簇) 序列信息?；谔囟ㄉ锖铣杀匦杌虻谋Ｊ匦蛄性O(shè)計寡核苷酸引物，通過PCR可以快速篩選潛在的具有特定化學(xué)結(jié)構(gòu)特點的抗生素產(chǎn)生菌[17-19]；再通過序列分析與比對，可以為推測菌株可能產(chǎn)生的抗生素化學(xué)結(jié)構(gòu)或類型提供重要的提示或參考。本文通過證實吸水鏈霉菌17997含有dTDP-葡萄糖-4,6-脫水酶基因，并通過序列分析表明它屬于洋橄欖葉素生物合成基因簇中與2-脫氧-L-巖藻糖生物合成相關(guān)的dTDP-葡萄糖-4,6-脫水酶基因，提示該菌株具有產(chǎn)生洋橄欖葉素的遺傳基礎(chǔ)，為推測抗革蘭陽性菌活性化合物為洋橄欖葉素提供了重要的參考。

洋橄欖葉素具有抗革蘭陽性菌、抗線蟲、抗原生動物、免疫抑制和抗哺乳動物腫瘤細胞等多種生物學(xué)活性；在基于單純的生物活性篩選模式的微生物次級代謝產(chǎn)物研究中，被重復(fù)發(fā)現(xiàn) (分離純化和化學(xué)結(jié)構(gòu)解析) 多次。本文報道了洋橄欖葉素及其產(chǎn)生菌的一種快速、簡易鑒定方法；其中，洋橄欖葉素在TLC硅膠板上用NaOH溶液噴涂顯紅色的特性屬于首次報道，其ESI(+)-MS2譜圖是首次公開給出，適用于洋橄欖葉素類化合物及其產(chǎn)生菌的早期快速鑒別和排重。洋橄欖葉素用NaOH溶液處理顯紅色的原理，推測是由于分子中的內(nèi)酯鍵在堿性條件下發(fā)生水解后分子再脫水增加一個共軛雙鍵，以及分子生成鈉鹽所致。

致謝：中國科學(xué)院成都生物研究所李國友博士惠贈洋橄欖葉素對照品。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所分析中心完成LC-MS分析。

REFERENCES

[1] He WQ. The studies on geldanamycin biosynthetic gene cluster in Streptomyces hygroscopicus 17997[D]. Beijing: Peking Union Medical College & Chinese Academy of Medical Sciences, 2006.赫衛(wèi)清. 吸水鏈霉菌17997中格爾德霉素生物合成基因簇的研究[D]. 北京: 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院, 2006.

[2] He WQ, Wu LZ, Gao QJ, et al. Identification of AHBA biosynthetic genes related to geldanamycin biosynthesis in Streptomyces hygroscopicus 17997. Curr Microbiol, 2006, 52(3):197?203.

[3] Gao QJ. Cloning and molecular analysis of ansamycins antibiotics biosynthetic gene cluster from Streptomyces hygroscopicus 17997, a geldanamycin producer[D]. Beijing: Peking Union Medical College & Chinese Academy of Medical Sciences, 2002.高群杰. Geldanamycin產(chǎn)生菌吸水鏈霉菌17997中安莎類抗生素生物合成基因簇的克隆與研究[D]. 北京: 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院, 2002.

[4] Gong YM, Chen J, Yang T, et al. Secondary metabolites with anti-Staphylococcus aureus activity from Streptomyces hygroscopicus. Chin J Appl Environ Biol, 2010, 16(2): 261?263.龔雨梅, 陳軍, 楊濤, 等. 吸水鏈霉菌抗金黃色葡萄球菌代謝產(chǎn)物. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報, 2010, 16(2): 261?263.

[5] Liu AM, Wu LZ, Zhang HT, et al. A color reaction method for early preliminary discrimination of benzenic ansamycins. Chin J Antibiotics, 2008, 33(7): 403?406.劉愛明, 武臨專, 張會圖, 等. 苯安莎類抗生素的一種早期鑒別方法. 中國抗生素雜志, 2008, 33(7): 403?406.

[6] Du Y, Li TB, Wang YG, et al. Identification and functional analysis of dTDP-glucose-4,6-dehydratase gene and its linked gene cluster in an aminoglycoside antibiotics producer of Streptomyces tenebrarius H6. Curr Microbiol, 2004, 49(2): 99?107.

[7] Xu P, Li WJ, Xu LH, et al. A microwave-based method for genomic DNA extraction from actinomycetes. Microbiol China, 2003, 30(4): 82?84.徐平, 李文均, 徐麗華, 等. 微波法快速提取放線菌基因組DNA. 微生物學(xué)通報, 2003, 30(4): 82?84.

[8] Antibiotics, Its Physiological and Biochemical Properties: Volume 1. Beijing: People’s Medical Publishing House. 1977: 526?527.抗菌素——生理生化特性: 第一分冊. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 1977: 526?527.

[9] Alvi KA, Peterson J, Hofmann B. Rapid identification of elaiophylin and geldanamycin in Streptomyces fermentation broths using CPC coupled with a photodiode array detector and LC-MS methodologies. J Ind Microbiol, 1995, 15(2): 80?84.

[10] Wang H, Cui CB, Han B, et al. Elaiophylins, new cell cycle inhibitors and apoptosis inducers, produced by Streptomyces pseudoverticillus I. Taxonomy, production and isolation. Chin J Antibiotics, 2001, 26(1): 19?24.王浩, 崔承彬, 韓冰, 等. 假輪枝鏈霉菌 Streptomyces pseudoverticillus產(chǎn)生的 elaiophylin類新細胞周期抑制劑及細胞凋亡誘導(dǎo)劑 I. 菌種鑒定、發(fā)酵生產(chǎn)及提取分離. 中國抗生素雜志, 2001, 26(1): 19?24.

[11] Yan SL, Huang WY. Research progress on azalomycin B. Microbiol China, 2002, 29(5): 103?107.嚴淑玲, 黃為一. 阿扎霉素 B (Azalomycin B) 研究進展. 微生物學(xué)通報, 2002, 29(5): 103?107.

[12] Haydock SF, Mironenko T, Ghoorahoo HI, et al. The putative elaiophylin biosynthetic gene cluster in Streptomyces sp. DSM4137 is adjacent to genes encoding adenosylcobalamin-dependent methylmalonyl CoA mutase and to genes for synthesis of cobalamin. J Biotechnol, 2004, 113(1/3): 55?68.

[13] Haltli BA. Elaiophylin biosynthetic gene cluster: US Patent, 7595187. 2009-09-29.

[14] Ritzau M, Heinze S, Fleck WF, et al. New macrodiolide antibiotics, 11-O-monomethyl- and 11, 11'-O-dimethylelaiophylins, from Streptomyces sp. HKI-0113 and HKI-0114. J Nat Prod, 1998, 61(11): 1337?1339.

[15] Fang A, Wong GK, Demain AL. Enhancement of the antifungal activity of rapamycin by the coproduced elaiophylin and nigericin. J Antibiot, 2000, 53(2): 158?162.

[16] Yan SL, Huang WY, Wang SM, et al. Extraction, purification and structure elucidation of antibiotic M1 in mycelia of Streptomyces hygroscopicus NND-52. Chin J Antibiotics, 2001, 26(3): 161?164.嚴淑玲, 黃為一, 王世梅, 等. 吸水鏈霉菌 NND-52菌株胞內(nèi)抗生素M1分離、純化及結(jié)構(gòu)確定. 中國抗生素雜志, 2001, 26(3): 161?164.

[17] Zhang HT, Wu LZ, Liu AM, et al. PCR screening of 3-amino-5-hydroxybenzoic acid synthase gene leads to identification of ansamycins and AHBA related antibiotic producers in actinomycetes. J Appl Microbiol, 2009, 106(3): 755?763.

[18] Hornung A, Bertazzo M, Dziarnowski A, et al. A genomic screening approach to the structure-guided identification of drug candidates from natural sources. ChemBioChem, 2007, 8(7): 757?766.

[19] Liu W, Ahlert J, Gao QJ, et al. Rapid PCR amplification of minimal enediyne polyketide synthase cassettes leads to a predictive familial classification model. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100(21): 11959?11963.