張勤，張梁，丁重陽，王正祥，石貴陽

1 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122

2 江南大學(xué)生物工程學(xué)院 生物資源與生物能源研究中心，無錫 214122

乳酸因其安全性、光學(xué)特性及其特殊的分子結(jié)構(gòu)被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品等工業(yè)。由于人體只能利用L(+)-乳酸，世界衛(wèi)生組織提倡在食品及醫(yī)藥行業(yè)使用 L(+)-乳酸取代目前普遍使用的DL(+)-乳酸[1-2]。另外，L-乳酸的一個(gè)重要用途為合成聚乳酸，聚乳酸因可以由可再生資源生產(chǎn)并能被生物降解而被認(rèn)為是最有發(fā)展前景的聚合物之一[3]。2009年世界L-乳酸需求量為13~l5萬t，主要集中在美國、西歐和日本，且需求量將以年均 5%~8 %的速度持續(xù)增長，加之聚乳酸的逐步推廣使用，L(+)-乳酸產(chǎn)業(yè)規(guī)模將急劇擴(kuò)大[4]。

目前，L-乳酸的生產(chǎn)方法主要為微生物發(fā)酵法?，F(xiàn)國內(nèi)外研究主要集中在乳桿菌和米根霉[5-6]。在乳酸發(fā)酵過程中，pH值會(huì)隨著乳酸的生成而逐漸降低，而低pH值會(huì)抑制細(xì)菌和根霉菌的生長和發(fā)酵能力[7]。雖然 CaCO3作為中和劑，可以維持最適 pH值。但是乳酸鈣結(jié)晶細(xì)小，且結(jié)晶過程不易控制，另外 30%乳酸鈣殘留在結(jié)晶母液中，不能結(jié)晶出來，大量的副產(chǎn)物 (石膏) 會(huì)造成環(huán)境污染。另外NaOH或NH4OH可也作為中和劑，但用量大、成本高[8-9]。

相對于細(xì)菌和霉菌，酵母菌具備更好的耐酸特性，可在強(qiáng)度更高的酸性條件下生存和生長。早在1994年Dequin和Barr就報(bào)道了代謝工程酵母菌株異源表達(dá)L-乳酸脫氫酶，其L-乳酸產(chǎn)量為12 g/L[10]。之后也有學(xué)者研究將來源于乳酸菌、米根霉和其他來源的乳酸脫氫酶在釀酒酵母中表達(dá)，其L-乳酸產(chǎn)量也提高至25.7 g/L和38.0 g/L[11-12]。

然而有文獻(xiàn)顯示，L-乳酸比其他大多數(shù)有機(jī)酸和無機(jī)酸引起的細(xì)胞內(nèi)酸化速度更快，對細(xì)胞造成的損傷更為嚴(yán)重[13]。因此，一般酵母和以 HCl或H2SO4等無機(jī)酸為篩選壓力得到的耐酸菌在 L-乳酸生產(chǎn)上并不能表現(xiàn)出其在耐酸方面的優(yōu)越性。本研究則以自然界中篩選得到的一株耐高濃度乳酸的酵母菌為出發(fā)菌株，在國內(nèi)首次采用基因工程技術(shù)，通過表達(dá)米根霉乳酸脫氫酶基因，改造野生耐酸酵母菌株，增加其乳酸代謝途徑，代謝葡萄糖生成乳酸?？梢越档蛡鹘y(tǒng)乳酸發(fā)酵過程中因添加鈣所產(chǎn)生的污染，也可降低氨水等中和劑的用量并簡化操作過程，可大幅度降低生產(chǎn)成本，為以耐酸酵母菌高產(chǎn)L-乳酸進(jìn)行了有益的探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

水果皮、土壤、酒曲等。

1.1.2 菌株與來源

本研究所用菌株及質(zhì)粒如表1所示。

表1 本研究中所用菌株及質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.3 培養(yǎng)基

YEPD培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L；蛋白胨20 g/L；酵母膏10 g/L。用于固體培養(yǎng)基時(shí)添加20 g/L瓊脂粉；挑選轉(zhuǎn)化子時(shí)添加800 mg/L的G418抗生素。

篩選培養(yǎng)基 (Selection medium)：葡萄糖20 g/L；蛋白胨 20 g/L；酵母膏10 g/L；以乳酸調(diào)節(jié)pH值至2.5。

單碳源培養(yǎng)基 (Solo carbon medium)：乳酸17 g/L；(NH4)2SO47.5 g/L；KH2PO43.5 g/L；MgSO4·7H2O 0.75 g/L；酵母膏0.5 g/L。

PDA培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L；馬鈴薯200 g/L，瓊脂粉20 g/L，用于米根霉的培養(yǎng)。

LB培養(yǎng)基：NaCl 10 g/L；蛋白胨10 g/L；酵母膏5 g/L。用于固體培養(yǎng)基時(shí)添加20 g/L瓊脂粉；挑選轉(zhuǎn)化子時(shí)添加終濃度為30 mg/L的卡那霉素。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 100 g/L，蛋白胨20 g/L；酵母膏10 g/L。

1.2 方法

1.2.1 采樣與分離

稱取5 g樣品，加至含100 mL無菌生理鹽水及玻璃珠的三角瓶中，30 ℃、150 r/min振蕩打散30 min；樣品懸液用無菌生理鹽水稀釋，選擇適合的稀釋度，分別涂布YEPD平板，30 ℃培養(yǎng)5~7 d，觀察菌落生長情況，并將新長出的形態(tài)上有差異的單菌落挑出。

1.2.2 耐酸酵母的篩選

從分離得到的單菌落中挑取典型的酵母菌落分別接種于以乳酸調(diào)節(jié)pH值至4的YEPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)48 h。選擇生長較好的酵母菌株依次接入篩選培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h，選擇長勢最好的菌株在YEPD試管斜面上劃線，4 ℃保存。

1.2.3 分類鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：按照文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行。

分子生物學(xué)鑒定：酵母DNA的提取方法參照《精偏分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》[15]，所用引物為真菌ITS通用引物 (上游 ITS1：5′-TCCGTAGGTGAA CCTGCGG-3′；下游ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGA TATGC-3′)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后測序，在核酸序列數(shù)據(jù) (GenBank) 中進(jìn)行同源序列搜索，根據(jù)同源序列搜索結(jié)果，確定該菌株所屬的最近屬種。

生理生化鑒定：按照文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行。

1.2.4 分析方法

生長量測定方法：取不同發(fā)酵時(shí)間的發(fā)酵液，用721型分光光度計(jì)于600 nm處測其吸光值。

殘?zhí)菧y定方法：生物傳感儀測定發(fā)酵液內(nèi)殘?zhí)呛俊?/p>

HPLC法測定有機(jī)酸：發(fā)酵液經(jīng)8 000 r/min離心5 min，取300 μL上清液加入700 μL無水乙醇沉淀蛋白質(zhì)3 h以上后，12 000 r/min離心15 min，0.45 μm有機(jī)微孔濾膜后，通過HPLC進(jìn)行測定。分析條件：色譜柱SH1011；流動(dòng)相0.01 mol/L H2SO4；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；柱溫50 ℃；檢測器為紫外檢測器，檢測波長為210 nm。

1.2.5 常規(guī)基因克隆操作方法

大腸桿菌感受態(tài)制備，外源基因片段與載體連接，簡易轉(zhuǎn)化操作，大腸桿菌質(zhì)粒快速提取，PCR擴(kuò)增，絲狀真菌基因組DNA制備等操作參見文獻(xiàn)[15]。

1.2.6 目的基因的PCR擴(kuò)增及克隆

根據(jù)米根霉 L-乳酸脫氫酶基因 (ldhA) 序列(GenBank Accession No. EF15228.1)，設(shè)計(jì)引物如下：Roldh1：5′-CGCGGATCC ATGGTATTACACTCA-3′，Roldh2：5′-CCGAAGCTT TCAACAGCTACTTTTA-3′(下劃線所示分別為BamHⅠ、HindⅢ酶切位點(diǎn))。 PCR反應(yīng)體系體積為50 μL，擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.2.7 質(zhì)粒的構(gòu)建

將PCR獲得的ldhA基因用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，經(jīng)純化后與經(jīng)同樣酶切的質(zhì)粒 pYX212-kanMX連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pYX212-kanMX-ldhA。

1.2.8 G418的敏感測定

收集耐酸酵母菌體，ddH2O洗滌2次后懸浮，30 ℃進(jìn)行饑餓培養(yǎng)2~3 h。培養(yǎng)后的細(xì)胞經(jīng)適當(dāng)稀釋后涂布于含不同濃度G418抗生素的YEPD平板，30 ℃培養(yǎng)3~4 d，觀察生長情況。

1.2.9 轉(zhuǎn)化方法

酵母轉(zhuǎn)化采用電穿孔轉(zhuǎn)化法，轉(zhuǎn)化后涂布于含G418抗性的YEPD平板，挑選轉(zhuǎn)化子。

電穿孔轉(zhuǎn)化條件：1 500 V，5 ms，電擊2次；電脈沖儀的型號為ECM399。

1.2.10 轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證

菌落PCR驗(yàn)證和SDS-PAGE電泳驗(yàn)證等操作均參見文獻(xiàn)[15]。

1.2.11 重組菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

種子液制備：將重組菌從YEPD抗性平板上刮取一單菌落至YEPD液體培養(yǎng)基 (250 mL三角瓶，裝液量為30 mL) 中，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，即為種子液，轉(zhuǎn)接發(fā)酵液時(shí)接種量為10%。

重組菌發(fā)酵產(chǎn)乳酸驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：將不同重組菌的種子液分別接種至發(fā)酵培養(yǎng)基 (250 mL三角瓶，裝液量為50 mL)，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)48 h。

發(fā)酵液初始pH值對發(fā)酵產(chǎn)乳酸的影響：分別在發(fā)酵培養(yǎng)基中滴加乳酸，使其培養(yǎng)基pH值分別為 2.5、3.0、3.5、4.0，并以未調(diào)節(jié) pH值的培養(yǎng)基 (pH 7.0) 作空白對照。將種子液分別轉(zhuǎn)接至已調(diào)節(jié)pH值的發(fā)酵培養(yǎng)基中 (250 mL三角瓶，裝液量為50 mL)，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)48 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐酸酵母的分離篩選

從自然界96個(gè)樣品中篩選出55株能在乳酸調(diào)節(jié)pH值達(dá)2.5的YEPD培養(yǎng)基中存活或生長的酵母菌株，其中17株酵母能夠生長。逐一經(jīng)YEPD培養(yǎng)基、乳酸篩選培養(yǎng)基和乳酸單碳源培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵初篩，以生長量為指標(biāo)進(jìn)一步復(fù)篩。對多個(gè)批次的酵母反復(fù)比較之后，確定一株編號為No.4的菌株能在pH值2.5 YEPD培養(yǎng)基中生長良好。

2.2 分類鑒定

2.2.1 生理生化與分子生物學(xué)鑒定

菌株No.4有典型的酵母菌株形態(tài)，細(xì)胞呈卵形或球形，多邊芽殖。對此菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，將此菌株的ITS序列與NCBI中同源性較高的幾株菌進(jìn)行比對和同源性分析，同源樹 (圖1) 清楚地顯示出以分子生物學(xué)特征為基礎(chǔ)，菌株No.4與NCBI中其他一些參考酵母菌株的親緣關(guān)系。由實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果可以推斷此耐酸酵母的分類地位應(yīng)屬于假絲酵母屬Candida sp.。同時(shí)對此菌進(jìn)行生理生化鑒定，結(jié)果如表 2所示，可初步推測該耐酸酵母應(yīng)屬于木蘭假絲酵母Candida magnolia。

圖1 DNAman軟件繪制菌株No.4的同源樹Fig. 1 Homology tree of strain No.4 drawn by DNAman.

表2 菌株No.4的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain No.4

2.2.2 C. magnolia的乳酸耐受性

對耐酸酵母C. magnolia 進(jìn)行乳酸耐受性實(shí)驗(yàn)，將其分別接種至添加不同量乳酸的 YEPD培養(yǎng)基中，觀察其乳酸含量對此耐酸菌生長的影響，其結(jié)果如圖2所示，在乳酸濃度低于68 g/L (pH值約為2.5) 時(shí)，培養(yǎng)基中的乳酸對C. magnolia的生長影響較小，高于68 g/L時(shí)，菌體生長逐漸受到抑制，但此耐酸菌在乳酸濃度高達(dá)93.5 g/L時(shí)，仍能夠生長，其OD可達(dá)到6.5，說明此菌對乳酸具有極高的耐受性，為耐酸微生物。

圖2 乳酸含量對培養(yǎng)基pH值 (A) 及C. magnolia生長(B) 的影響Fig. 2 Effect of concentration of lactic acid on the pH of medium (A) and the growth of C. magnolia (B).

2.2.3 C. magnolia的有機(jī)酸利用分析

對耐酸酵母C. magnolia進(jìn)行有機(jī)酸利用實(shí)驗(yàn)，將其分別接種至篩選培養(yǎng)基和單碳源培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)在篩選培養(yǎng)基中生長旺盛，而在單碳源培養(yǎng)基中基本不能生長，且C. magnolia 對乳酸的利用率均低于5%。說明C. magnolia 能在營養(yǎng)豐富的高濃度乳酸條件正常生長，但不能在以乳酸為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長。

2.3 產(chǎn)乳酸重組菌的構(gòu)建

因?yàn)?C. magnolia 的耐乳酸而不利用乳酸的特性，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以此菌為研究對象，通過表達(dá)米根霉乳酸脫氫酶基因，試圖將代謝流引向乳酸形成方向，以達(dá)到生產(chǎn)乳酸的目的。

2.3.1 質(zhì)粒構(gòu)建及酶切

按照 1.2.7構(gòu)建質(zhì)粒，得到表達(dá)載體 pYX212-kanMX-ldhA，將該質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖 3所示，證明質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖3 重組表達(dá)載體pYX212-kanMX-ldhA的鑒定Fig. 3 Identification of recombinant expression vector pYX212-kanMX-ldhA. 1: plasmid pYX212-kanMX digested with BamH I digestion; 2: identification of recombinant plasmid pYX212-kanMX-ldhA by PCR; 3: recombinant plasmid pYX212-kanMX-ldhA digested with BamH I and Hind III digestion; 4: recombinant plasmid pYX212-kanMX-ldhA digested with BamH I digestion; 5: λDNA/Pst I marker.

2.3.2 G418的敏感測定

重組菌的篩選要以G418抗生素為篩選壓力，因此需要測定原始耐酸酵母對G418抗生素的敏感性，按照 1.2.8進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)能夠完全抑制原始耐酸酵母菌株C. magnolia生長的最低G418濃度為800 mg/L。因此在后續(xù)篩選轉(zhuǎn)化子實(shí)驗(yàn)中，均在培養(yǎng)基中添加800 mg/L的G418來抑制原始菌的生長。

2.3.3 質(zhì)粒pYX212-kanMX-ldhA的電轉(zhuǎn)化和篩選重組酵母轉(zhuǎn)化子

將質(zhì)粒 pYX212-kanMX-ldhA電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)酵母C. magnolia 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化后的酵母涂布在含800 mg/L G418抗生素的YEPD平板上，按照1.2.9挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落 PCR擴(kuò)增，電泳驗(yàn)證(PCR擴(kuò)增ldhA片段)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株C. magnolia-2和C. magnolia-3均有一條大小約為1.0 kb的片段，與ldhA片段大小基本一致，而對照原始菌株則沒有，因此推測此條帶即為 ldhA片段。即 C. magnolia-2和 C. magnolia-3已成功轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒 pYX212-kanMX-ldhA。

將經(jīng) PCR驗(yàn)證的轉(zhuǎn)化子 C. magnolia-2、C. magnolia-3、及原始菌株 C. magnolia 進(jìn)行細(xì)胞破碎，細(xì)胞破碎液稀釋適當(dāng)濃度后進(jìn)行SDS-PAGE電泳驗(yàn)證，結(jié)果如圖4所示，轉(zhuǎn)化子C. magnolia-2和C. magnolia-3均在相對分子量約為43 kDa附近出現(xiàn)了明顯的蛋白表達(dá)條帶，與預(yù)期大小相一致，而原始菌C. magnolia 則未見此蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步證明了C. magnolia-2和C. magnolia-3為陽性轉(zhuǎn)化子，外源乳酸脫氫酶基因已得到表達(dá)。

2.4 產(chǎn)乳酸酵母發(fā)酵性能的研究

2.4.1 重組菌發(fā)酵產(chǎn)乳酸驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為測定上述實(shí)驗(yàn)所得重組菌的發(fā)酵能力，進(jìn)行通風(fēng)發(fā)酵產(chǎn)乳酸實(shí)驗(yàn)。將重組菌C. magnolia-2和C. magnolia-3及原始菌株C. magnolia接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，其結(jié)果如圖 5所示，原始菌株不能利用葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，而重組菌在發(fā)酵過程中明顯有乳酸生成，且隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，乳酸逐漸得到積累。對C. magnolia-2和C. magnolia-3兩株重組菌的最終乳酸含量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)C. magnolia-2最終乳酸含量略高于C. magnolia-3，因此在后續(xù)發(fā)酵試驗(yàn)中選擇C. magnolia-2進(jìn)一步研究。

圖4 C. magnolia及其重組菌SDS-PAGE電泳驗(yàn)證結(jié)果Fig. 4 SDS-PAGE of C. magnolia and its recombinant cells. 1: C. magnolia; 2: C. magnolia-2; 3: C. magnolia-3; 4: protein marker.

圖5 重組菌產(chǎn)乳酸性能的驗(yàn)證Fig. 5 Different recombinants fermented in fermentation medium. Solid line represents the concentration of glucose, and dash line represents the concentration of lactic acid.

2.4.2 發(fā)酵液初始pH值對發(fā)酵產(chǎn)乳酸的影響

因宿主菌為耐酸菌，為研究此重組菌是否同樣可在酸性條件下具有發(fā)酵生成乳酸的能力，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)將C. magnolia-2分別接種于pH值不同的發(fā)酵培養(yǎng)基。其結(jié)果如圖6所示，重組菌C. magnolia-2于培養(yǎng)基pH值范圍在2.5~7.0范圍內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵，均能轉(zhuǎn)化葡萄糖生成乳酸，且在pH為3.5時(shí)糖酸轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到16%以上。

圖6 培養(yǎng)基初始pH值對發(fā)酵產(chǎn)乳酸的影響Fig. 6 Effect of initial pH on lactic acid production. LAC: lactic acid.

3 討論

在酵母產(chǎn)乳酸工程菌研究方面，國外已有報(bào)道。Skory等將米根霉的 L-乳酸脫氫酶基因轉(zhuǎn)入釀酒酵母中，在pH 5.5時(shí)糖酸轉(zhuǎn)化率最高時(shí)，在pH 3.5時(shí)，糖酸轉(zhuǎn)化率降低了約10%，產(chǎn)酸明顯受到了抑制[6]；其他關(guān)于應(yīng)用酵母生產(chǎn)L-乳酸的研究，絕大多數(shù)依舊需要以 CaCO3、NaOH或氨水調(diào)節(jié)，將發(fā)酵過程的pH值控制在4~6.6，才能使發(fā)酵正常進(jìn)行[10-12]，說明這些工程菌株在乳酸耐受性方面并沒有很大的優(yōu)勢。

本研究首次從自然界中篩選得到一株耐高濃乳酸 (以乳酸調(diào)節(jié)pH值至2.5) 的耐酸酵母菌株，并且此耐酸菌株不能利用乳酸。對該菌進(jìn)行分子生物學(xué)和生理生化鑒定后推斷其分類地位為木蘭假絲酵母C. magnolia。并首次以此為出發(fā)菌株，采用基因工程育種技術(shù)，在耐酸酵母中表達(dá)米根霉乳酸脫氫酶基因，構(gòu)建乳酸代謝途徑，代謝葡萄糖生成乳酸，證明了利用基因工程技術(shù)使此耐酸酵母生產(chǎn)乳酸的可行性。重組菌在pH 2.5~7.0之間均能有效生成乳酸，在pH值為3.5時(shí)，糖酸轉(zhuǎn)化率最高，并且在發(fā)酵過程中pH值降低至2.5時(shí)，仍有乳酸繼續(xù)生成。因此，該重組菌在乳酸發(fā)酵過程中大幅減少碳酸鈣等中和劑用量方面表現(xiàn)出較好的應(yīng)用前景；同時(shí)，在低 pH條件下可以一定程度上減少雜菌的污染幾率。

將本實(shí)驗(yàn)所得的重組菌應(yīng)用于乳酸發(fā)酵時(shí)，初步優(yōu)化其培養(yǎng)條件，即可使乳酸產(chǎn)量達(dá)到40 g/L以上 (數(shù)據(jù)另發(fā))，表明重組菌株通過進(jìn)一步的發(fā)酵工藝優(yōu)化具有較好的提升空間。下一步工作中，為提高乳酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率，可在本文構(gòu)建的菌株基礎(chǔ)上深入研究中間代謝產(chǎn)物積累與乳酸積累之間的關(guān)系，并確定其他可能的限速因素，如乙醇、甘油和NADH等對酵母乳酸代謝的影響，最終解決由于中間代謝產(chǎn)物的積累而導(dǎo)致乳酸產(chǎn)量較低的問題；對發(fā)酵條件如 pH值和溶氧等進(jìn)行精確調(diào)節(jié)控制也可進(jìn)一步提高發(fā)酵水平。同時(shí)，基于本文的研究策略，通過更換乳酸脫氫酶基因的啟動(dòng)子等調(diào)控序列或通過增加拷貝數(shù)以增強(qiáng)其乳酸脫氫酶的酶活，將有可能進(jìn)一步較大幅度提高乳酸發(fā)酵產(chǎn)率。

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