倪輝，洪清林，肖安風(fēng),2，李利君，蔡慧農(nóng)，蘇文金

1 集美大學(xué)生物工程學(xué)院，廈門(mén) 361021

2 福建省高校食品微生物與酶工程技術(shù)研究中心，廈門(mén) 361021

3 廈門(mén)市食品與生物工程技術(shù)研究中心，廈門(mén) 361021

蝦青素 (Astaxanthin) 是一種含氧類(lèi)胡蘿卜素，具有超強(qiáng)的抗氧化活性，同時(shí)還具有抑制腫瘤發(fā)生、增強(qiáng)免疫、抗炎癥、機(jī)體著色等多種生物學(xué)功能，在功能性食品、飼料、化妝品、醫(yī)藥等方面有著廣泛的應(yīng)用[1-3]。

利用法夫酵母Phaffia rhodozyma發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素具有發(fā)酵條件容易滿(mǎn)足、發(fā)酵培養(yǎng)基簡(jiǎn)單、易實(shí)現(xiàn)工廠(chǎng)化生產(chǎn)、不受氣候條件影響等優(yōu)點(diǎn)，是最具產(chǎn)業(yè)化前景的天然蝦青素生產(chǎn)方法[5-6]。上世紀(jì) 80年代以后，人們從蝦青素的合成機(jī)理[7]、優(yōu)良菌株選育[8-10]、發(fā)酵工藝條件優(yōu)化[11-16]、提取工藝優(yōu)化[17-18]、廉價(jià)培養(yǎng)基的選擇[19-20]及蝦青素合成酶基因的克隆與表達(dá)[21]等多方面對(duì)法夫酵母發(fā)酵蝦青素進(jìn)行了全面研究，雖然已經(jīng)基本闡明了法夫酵母的生物學(xué)特性、蝦青素的合成代謝機(jī)理、發(fā)酵培養(yǎng)基的基本成分和發(fā)酵條件，但到目前為止，所報(bào)道的法夫酵母的蝦青素細(xì)胞產(chǎn)率最高為3~3.5 mg/g[9-10,22]，蝦青素發(fā)酵產(chǎn)量最高為 60 mg/L[22]，蝦青素的發(fā)酵水平一直停滯不前，蝦青素的產(chǎn)業(yè)化發(fā)酵一直沒(méi)有成功，很多科研單位及企業(yè)都放棄了對(duì)蝦青素發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)繼續(xù)進(jìn)行研究，近年來(lái)相關(guān)研究陷入了低谷。

雖然目前很容易購(gòu)買(mǎi)到先進(jìn)的發(fā)酵設(shè)備及建立工業(yè)發(fā)酵技術(shù)，但沒(méi)有選育獲得符合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)要求的高產(chǎn)菌株制約了蝦青素發(fā)酵技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。因此，選育優(yōu)良的生產(chǎn)菌種是提高蝦青素發(fā)酵水平、推動(dòng)蝦青素發(fā)酵產(chǎn)業(yè)化的最根本途徑。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究基礎(chǔ)上[14,22]，選育得到了一株高產(chǎn)蝦青素的法夫酵母 (Phaffia rhodozyma JMU-MVP14)，其蝦青素細(xì)胞產(chǎn)率可達(dá)到 5 g/L以上，從出發(fā)菌株(Phaffia rhodozyma JMU-668) 所能達(dá)到的生物量(60 g/L) 來(lái)看，對(duì)該菌株進(jìn)行高密度發(fā)酵，其蝦青素產(chǎn)量應(yīng)該能達(dá)到300 mg/L以上。按目前蝦青素的市場(chǎng)價(jià)值 ($2 000/kg) 估算，如果蝦青素的發(fā)酵產(chǎn)量能達(dá)到 200 mg/L，則其生產(chǎn)成本和產(chǎn)品價(jià)值相當(dāng)，如果發(fā)酵產(chǎn)量高于250 mg/L，則具有產(chǎn)業(yè)化發(fā)酵價(jià)值；以此為根據(jù)，該菌株應(yīng)該是一株具有產(chǎn)業(yè)化前景的高產(chǎn)菌株。因此，進(jìn)一步評(píng)估該菌株的生產(chǎn)性能，明確該菌株是否具有產(chǎn)業(yè)化價(jià)值對(duì)于蝦青素的發(fā)酵生產(chǎn)具有重要的意義。

前期試驗(yàn)表明，Phaffia rhodozyma JMU-MVP14的生長(zhǎng)及產(chǎn)蝦青素的條件與其他法夫酵母菌株相似，但發(fā)酵pH值的調(diào)控方式及補(bǔ)料液成分對(duì)蝦青素的合成卻具有較大的影響。針對(duì)這些情況，本文在對(duì)發(fā)酵 pH值的調(diào)控方式及補(bǔ)料液成分進(jìn)行比較研究的基礎(chǔ)上，側(cè)重于考察該菌株高密度發(fā)酵蝦青素的生產(chǎn)性能，為后續(xù)研究及產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

法 夫 酵 母 出 發(fā) 菌 株 (Phaffia rhodozyma JMU-668)：由法夫酵母 Pst-1菌株 (德國(guó)柏林工業(yè)大學(xué)stahl教授贈(zèng)送) 經(jīng)紫外誘變，用薄層色譜法篩選得到，其特點(diǎn)是蝦青素占總類(lèi)胡蘿卜素的95%以上。

法夫酵母蝦青素高產(chǎn)菌株 (Phaffia rhodozyma JMU-MVP14)：由出發(fā)菌株經(jīng)甲基磺酸乙酯誘變，用 0.5%的雙氧水結(jié)合紫外照射產(chǎn)生自由基淘汰低產(chǎn)菌株選育得到，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基與種子培養(yǎng)基：4o Bx麥汁培養(yǎng)基，pH 6.0；制備斜面培養(yǎng)基時(shí)添加1.5%的瓊脂。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 20 g/L，硫酸銨5 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，氯化鈣0.2 g/L，酵母膏3 g/L，pH 6.0。

分批發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 30 g/L，硫酸銨5 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，氯化鈣0.2 g/L，酵母膏2 g/L，pH 6.0。

補(bǔ)料分批發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，硫酸銨5 g/L，磷酸二氫鉀3 g/L，硫酸鎂3 g/L，酵母膏15 g/L，pH 6.0。

1.1.3 試劑及藥品

蝦青素標(biāo)準(zhǔn)樣品購(gòu)自Sigma試劑公司；葡萄糖(分析純)、磷酸二氫鉀 (分析純)、氯化鈣 (分析純)、硫酸氨 (分析純)、無(wú)水硫酸鎂 (分析純)、3,5-二硝基水楊酸 (分析純)、氫氧化鈉 (分析純)、亞硫酸鈉(分析純)、無(wú)水乙醇 (分析純)、二甲亞砜 (化學(xué)純)、酵母膏等都為上海國(guó)藥集團(tuán)有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器

FA2004型電子天平 (上海精密科學(xué)儀器有限公司)，LXJ-IIB型低速大容量多管離心機(jī) (上海安亭分析儀器廠(chǎng))，ZHWY-2102型雙層全溫度恒溫?fù)u床(上海智城分析儀器制造有限公司)，SP-DJ系列垂直凈化工作臺(tái) (上海浦東偉普凈化設(shè)備廠(chǎng))，101-3B型電熱鼓風(fēng)干燥箱 (上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠(chǎng))，UV-2600A型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) (尤尼柯 (上海) 儀器有限公司)，NBS Bioflo-110 7 L發(fā)酵罐 (New Brunswick Scientific Company)，GUJT100L-1000L型中試型發(fā)酵罐 (鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限責(zé)任公司)，Waters 1525 型液相色譜儀 (Waters Corporation，Milford，MA，USA)。

1.2 方法

1.2.1 搖瓶種子的制備

將斜面活化的菌種接種于裝有30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，于22 ℃、190 r/min 培養(yǎng)96 h得到1代搖瓶種子。取1 mL 1代搖瓶種子轉(zhuǎn)接到新鮮的種子培養(yǎng)基中，在相同的條件下培養(yǎng)48 h得到搖瓶種子。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)

將1 mL搖瓶種子接入裝有30 mL搖瓶培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，在22 ℃、190 r/min的條件下培養(yǎng)120 h后測(cè)定發(fā)酵液中的生物量、總類(lèi)胡蘿卜素及蝦青素。

1.2.3 7 L罐分批發(fā)酵試驗(yàn)

以5%的接種量將搖瓶種子接種至裝有5 L發(fā)酵培養(yǎng)基的7 L發(fā)酵罐中，控制發(fā)酵溫度22 ℃，發(fā)酵pH 6.0，通氣量為3 L/min，通過(guò)調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速將溶氧控制在 30%~50%之間進(jìn)行發(fā)酵，轉(zhuǎn)速下限為200 r/min，上限為800 r/min，定時(shí)取樣分析，對(duì)比以下兩種pH調(diào)控方式對(duì)發(fā)酵的影響。

1) 自動(dòng)流加控制pH值：整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)用10%氨水自動(dòng)流加調(diào)控pH值。

2) 手動(dòng)間歇調(diào)整 pH值：發(fā)酵初始時(shí) pH隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，發(fā)酵至60 h，pH降低至2.5，打開(kāi)堿泵補(bǔ)氨水使pH值升高至6.14后關(guān)閉堿泵，發(fā)酵至72 h，pH降低至3.77，補(bǔ)氨水使pH值升高至5.98后關(guān)閉堿泵后繼續(xù)發(fā)酵直至108 h。

1.2.4 7 L罐補(bǔ)料分批發(fā)酵試驗(yàn)

整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中溶氧控制在 30%~50%之間，每隔12 h取樣測(cè)定發(fā)酵液中的糖度，當(dāng)糖度低于1%時(shí)進(jìn)行補(bǔ)料使發(fā)酵液的葡萄糖濃度達(dá)到4%，控制發(fā)酵過(guò)程中糖濃度為 1%~4%，通過(guò)檢測(cè)樣品的生物量、蝦青素及總類(lèi)胡蘿卜素含量，對(duì)比兩種補(bǔ)料液對(duì)補(bǔ)料分批發(fā)酵蝦青素的影響。補(bǔ)料液 1為50%的葡萄糖；補(bǔ)料液2為50%的葡萄糖、0.5%的酵母膏及0.3%的玉米漿。

1.2.5 1 m3罐發(fā)酵試驗(yàn)

以2%的接種量將搖瓶種子接種至裝有75 L發(fā)酵培養(yǎng)基的100 L種子罐中，在溫度22 ℃、pH 6.0、溶氧 30%~50%的條件下培養(yǎng) 72 h，轉(zhuǎn)接入裝有750 L發(fā)酵培養(yǎng)基的1 m3發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵過(guò)程中控制發(fā)酵溫度22 ℃，利用10%氨水自動(dòng)流加控制pH為6.0，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量控制溶氧值在30%~50%之間，每隔12 h取樣測(cè)定發(fā)酵液中的糖濃度，當(dāng)初糖耗完后，流加60%的葡萄糖液維持發(fā)酵液糖濃度不大于1 g/L。

1.3 檢測(cè)方法

用干重法測(cè)定生物量[22]，液相色譜法測(cè)定蝦青素含量[22]，紫外分光光度法測(cè)定總類(lèi)胡蘿卜素[22]，3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖[23]；總蛋白、總脂肪、總糖及灰分測(cè)定采用AOAC推薦的方法[24]。

1.4 相關(guān)參數(shù)及其縮寫(xiě)

相關(guān)參數(shù)的計(jì)算公式及其縮寫(xiě)見(jiàn)表1。

1.5 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的計(jì)算

用 Monod模型描述發(fā)酵生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，用Luedeking-Piret模型描述產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

搖瓶試驗(yàn)為5次平行試驗(yàn)的平均值，用DPS軟件進(jìn)行顯著性分析；罐上發(fā)酵為3次平行測(cè)定的平均值，一次參數(shù)用Excel軟件計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差，并在作圖時(shí)添加誤差線(xiàn)，二次參數(shù)由一次參數(shù)的平均值計(jì)算。

表1 發(fā)酵參數(shù)的計(jì)算及公式Table 1 Fermentation parameters and their calculations

2 結(jié)果與分析

2.1 搖瓶培養(yǎng)

如表 2所示，高產(chǎn)菌株 (P. rhodozyma JMUMVP14) 的生物量顯著低于出發(fā)菌株 (P. rhodozyma JMU-668)，而總類(lèi)胡蘿卜素的體積產(chǎn)率、蝦青素體積產(chǎn)率、總類(lèi)胡蘿卜素細(xì)胞產(chǎn)率、蝦青素細(xì)胞產(chǎn)率分別是28.45 mg/L、16.53 mg/L、10.38 mg/L及6.01 mg/g，都顯著高于出發(fā)菌株。

2.2 7 L罐分批發(fā)酵

如圖 1所示，用自動(dòng)流加的方式控制發(fā)酵液的pH，法夫酵母JMU-MVP14的糖消耗、生物量、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速率、生長(zhǎng)比速率等都大于手動(dòng)間歇調(diào)節(jié)pH的發(fā)酵模式。由圖2可知，用自動(dòng)流加的方式控制發(fā)酵液的pH，表征法夫酵母JMU-MVP14蝦青素合成的主要參數(shù)，即蝦青素的體積產(chǎn)率、細(xì)胞產(chǎn)率、合成速率、合成比速率等都大于手動(dòng)間歇調(diào)節(jié)pH的發(fā)酵模式。對(duì)自動(dòng)流加控制pH值的發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，其生長(zhǎng)及產(chǎn)物合成動(dòng)力學(xué)如圖3所示，μmax和Ks分別為0.20 h?1及21.73 g/L (圖3A)；產(chǎn)物合成的模型可表示為 qp=0.74μ+0.15 (圖3B)，說(shuō)明該法夫酵母合成蝦青素的模型為部分生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型，即部分蝦青素是在生長(zhǎng)時(shí)合成的，而更多的蝦青素是在細(xì)胞生長(zhǎng)后合成的。

表2 高產(chǎn)菌株與出發(fā)菌株搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Comparison of astaxanthin high producing strain and original strain by flask experiments

圖1 pH值控制方式對(duì)法夫酵母JMU-MVP14生長(zhǎng)及糖消耗的影響Fig. 1 Effects of the pH value controlling style on the growth and sugar utilization of P. rhodozyma JMU-MVP14. (A) Comparison of the sugar utilization. (B) Comparison of the biomass. (C) Comparison of the growth speed. (D) Comparison of the specific growth rate. The fermented sample by auto-controlling pH value at 6.0 (■). The fermented sample by discontinuously adjusting pH value at 6.0 (□).

2.3 7 L罐補(bǔ)料分批發(fā)酵

圖2 pH值控制方式對(duì)法夫酵母JMU-MVP14蝦青素合成的影響Fig. 2 Effects of the pH value controlling style on the astaxanthin syntheses of P. rhodozyma JMU-MVP14. (A) The volumetric productivity of astaxanthin. (B) The specific productivity of astaxanthin. (C) The synthesis speed of astaxanthin. (D) The specific productive rate of astaxanthin. The fermented samples by auto-controlling pH value at 6.0 (■); the fermented samples by discontinuously adjusting pH value at 6.0 (□).

圖3 法夫酵母JMU-MVP14生長(zhǎng)及產(chǎn)物合成動(dòng)力學(xué)分析Fig. 3 Kinetic analysis of the growth and astaxanthin production of P. rhodozyma JMU-MVP14. (A) The kinetic model of growth. (B) The kinetic model of astaxanthin synthesis.

圖4 補(bǔ)料培養(yǎng)基對(duì)法夫酵母JMU-MVP14生長(zhǎng)的影響Fig. 4 Effects of the feeding medium on the growth of comparison of the growth of P. rhodozyma JMU-MVP14. The feeding medium containing glucose only (■). The feeding medium containing glucose as well as yeast extract and corn syrup (□).

如圖 4所示，在發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)充酵母膏及玉米漿不但不能提高生物量，相反其生物量還低于只補(bǔ)充葡萄糖時(shí)的情況。如圖 5所示，在發(fā)酵過(guò)程中只補(bǔ)充葡萄糖液，總類(lèi)胡蘿卜素的體積產(chǎn)率、總類(lèi)胡蘿卜素的細(xì)胞產(chǎn)率、蝦青素的體積產(chǎn)率、蝦青素的細(xì)胞產(chǎn)率都大于同時(shí)補(bǔ)充葡萄糖和有機(jī)氮源時(shí)的對(duì)應(yīng)值。這說(shuō)明法夫酵母JMU-MVP14對(duì)氮源及生長(zhǎng)因子的要求不高，增加酵母膏及玉米漿的含量并不能提高蝦青素的產(chǎn)量，相反會(huì)降低蝦青素的產(chǎn)量。在7 L罐中進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，最大生物量、蝦青素體積產(chǎn)率、蝦青素細(xì)胞產(chǎn)率、總類(lèi)胡蘿卜素體積產(chǎn)率、總類(lèi)胡蘿卜素細(xì)胞產(chǎn)率分別達(dá)到了32.81 g/L、155.99 mg/L、4.94 mg/g、399.99 mg/L、12.19 mg/g (圖4~5)。

2.4 1 m3罐分批補(bǔ)料分批發(fā)酵

如圖6所示，在1 m3罐中補(bǔ)料分批發(fā)酵蝦青素，當(dāng)初糖耗完后，葡萄糖濃度一直都維持在相對(duì)比較低的水平；生物量在發(fā)酵前期快速增加，至發(fā)酵后期增加速度變慢；總類(lèi)胡蘿卜素在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中都快速增加；蝦青素在發(fā)酵前期快速增加，后期增加速度變慢，蝦青素占總色素的百分比一直維持在47%左右 (數(shù)據(jù)未列出)；至發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，生物量為85.11 g/L、蝦青素體積產(chǎn)率、總類(lèi)胡蘿卜素體積產(chǎn)率都達(dá)到最大，分別為 279.96 mg/L及618.01 mg/L；此時(shí)，蝦青素和總類(lèi)胡蘿卜素的細(xì)胞產(chǎn)率分別為3.29 mg/g 和7.26 mg/g，菌體中蛋白質(zhì)含量為21.54%，總糖為41.34%，脂肪為34.31%，灰分為1.58% (圖7)。

3 討論

選育優(yōu)良菌株及提高蝦青素的發(fā)酵產(chǎn)量是蝦青素發(fā)酵生產(chǎn)研究的主要課題，法夫酵母JMU-MVP14菌株的蝦青素含量遠(yuǎn)高于目前所報(bào)道最好的蝦青素生產(chǎn)菌株[9-10,22,25]；其總類(lèi)胡蘿卜素含量接近了An等根據(jù)熒光量及法夫酵母體積預(yù)測(cè)的類(lèi)胡蘿卜素含量的極限值 (15 mg/g)[26]。該法夫酵母的 μmax與相關(guān)研究結(jié)果相近[27-29]，Ks與Meyer等的研究結(jié)果相近[25]，但高于 Reynders及本實(shí)驗(yàn)室的前期研究結(jié)果[22,29]。μmax及Ks表明法夫酵母JMU-MVP14在高糖濃度下可以快速生長(zhǎng)，明顯區(qū)別于其他法夫酵母菌株所顯示的 Crabtree效應(yīng)[29]。法夫酵母JMU-MVP14合成蝦青素的模型為部分生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型(圖3B)，與其他報(bào)道的蝦青素合成模型相似[30]，但其蝦青素合成的兩個(gè)參數(shù)0.74 (表示每生長(zhǎng)1 g菌體就合成0.74 mg蝦青素) 及0.15 (表示每g菌體每小時(shí)合成 0.15 mg的蝦青素) 都遠(yuǎn)大于其他報(bào)道的菌株[22,30]。

圖5 補(bǔ)料培養(yǎng)基對(duì)補(bǔ)料分批發(fā)酵過(guò)程中總類(lèi)胡蘿卜及蝦青素的影響Fig. 5 Effect of the feed medium on the production of total carotenoids and astaxanthin by batch-fed culture. (A) The volumetric productivity of total carotenoids. (B) The specific productivity of total carotenoids. (C) The volumetric productivity of astaxanthin. (D) The specific productivity of astaxanthin. The feeding medium containing glucose only (■); The feeding medium containing glucose as well as yeast extract and corn syrup (□).

圖6 1 m3罐補(bǔ)料分批培養(yǎng)法夫酵母JMU-MVP14的結(jié)果Fig. 6 Results of the batch-fed cultivation of P. rhodozyma JMU-MVP14 in 1 m3 fermentor. Volumetric productivity of astaxanthin (■). Volumetric productivity of total carotenoids (△). Biomass (●). Residual sugar (×).

圖7 法夫酵母JMU-MVP14菌體的主要成分Fig. 7 Main composition of P. rhodozyma JMU-MVP14.

蝦青素是胞內(nèi)脂溶性產(chǎn)物，受細(xì)胞容積及脂肪含量的限制及影響，每個(gè)法夫酵母細(xì)胞只能合成極有限的蝦青素，蝦青素素的產(chǎn)量是其細(xì)胞產(chǎn)率與法夫酵母生物量的乘積，要實(shí)現(xiàn)蝦青素的高產(chǎn)發(fā)酵，不僅要有高產(chǎn)菌株，還要求建立高密度培養(yǎng)技術(shù)，在保持蝦青素細(xì)胞產(chǎn)率較高的前提下，盡可能提高其生物量。前期研究表明，當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度超過(guò)40 g/L時(shí)，法夫酵母JMU-MVP14菌株的生長(zhǎng)速度及細(xì)胞得率系數(shù)就會(huì)顯著降低，因此，用含有高濃度葡萄糖的培養(yǎng)基進(jìn)行分批發(fā)酵不能獲得蝦青素的高產(chǎn)，而采用補(bǔ)料分批發(fā)酵的模式，用葡萄糖濃度較低的初始培養(yǎng)基培養(yǎng)法夫酵母，當(dāng)初糖消耗以后，補(bǔ)充一定濃度的葡萄糖，控制發(fā)酵液中葡萄糖的濃度不超過(guò)40 g/L，當(dāng)該部分葡萄糖消耗以后，繼續(xù)補(bǔ)充葡萄糖，如此不斷循環(huán)，隨著葡萄糖不斷補(bǔ)充到發(fā)酵液中，生物量及蝦青素產(chǎn)量將按一定的比例不斷增加，用這種模式進(jìn)行發(fā)酵，最終可獲得很高的生物量及蝦青素產(chǎn)量。根據(jù)補(bǔ)料分批發(fā)酵的理論及前期研究基礎(chǔ)，從以下 3個(gè)方面開(kāi)展研究：1) 確定發(fā)酵過(guò)程中pH值的控制模式；2) 確定補(bǔ)料分批發(fā)酵過(guò)程中的補(bǔ)料培養(yǎng)基成分；3) 用1 m3罐中試測(cè)定法夫酵母JMU-MVP14及其補(bǔ)料分批發(fā)酵蝦青素的生產(chǎn)性能，建立了法夫酵母JMU-MVP14菌株罐上高產(chǎn)發(fā)酵蝦青素的工藝。結(jié)果表明采用氨水自動(dòng)流加的方式調(diào)控pH值，用葡萄糖漿為補(bǔ)料培養(yǎng)基相對(duì)間歇手動(dòng)調(diào)控pH及用葡萄糖、酵母膏、玉米漿組成的補(bǔ)料培養(yǎng)基更有利于蝦青素的合成。與搖瓶及7 L罐分批發(fā)酵相比，在7 L罐及1 m3罐中進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，由于發(fā)酵結(jié)束時(shí)總耗糖量大量增加，法夫酵母JMU-MVP14的生物量大幅度提高，生物量的提高導(dǎo)致了蝦青素的產(chǎn)量 (體積產(chǎn)率) 大幅度提高，如，搖瓶發(fā)酵、7 L罐分批發(fā)酵、7 L罐補(bǔ)料分批發(fā)酵及 1 m3罐補(bǔ)料分批發(fā)酵的生物量分別是 2.75、11.20、32.80、85.11 g/L，與生物量相對(duì)應(yīng)的蝦青素含量分別為28.45、72.47、155.99、279.96 mg/L。

發(fā)酵中試是建立產(chǎn)業(yè)化發(fā)酵工藝的必要環(huán)節(jié)，在1 m3發(fā)酵罐中進(jìn)行的發(fā)酵試驗(yàn)所達(dá)到的產(chǎn)量水平具有重要的產(chǎn)業(yè)化發(fā)酵參考價(jià)值。本研究中，1 m3罐的蝦青素產(chǎn)量及生物量都高于7 L罐中補(bǔ)料分批發(fā)酵的相應(yīng)值，說(shuō)明在小罐中建立的蝦青素補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝容易在中試型發(fā)酵罐中得到實(shí)現(xiàn)，只要保持相同的攪拌流型，采用氨水自動(dòng)流加控制pH，溶氧與轉(zhuǎn)速相偶聯(lián)控制在 30%~50%，就可實(shí)現(xiàn)在中試罐中高產(chǎn)發(fā)酵蝦青素。1 m3罐及7 L罐中蝦青素細(xì)胞產(chǎn)率分別為4.94 mg/g及3.29 mg/g，說(shuō)明1 m3罐的蝦青素產(chǎn)量比7 L罐更高的原因并不是蝦青素細(xì)胞產(chǎn)率提高引起的，而是由于生物量的提高所造成的?，F(xiàn)代發(fā)酵理論表明，中試型發(fā)酵罐與5 L或7 L罐相比，其傳質(zhì)條件的改善往往會(huì)引起生物量及目標(biāo)產(chǎn)物濃度的增高，這是引起1 m3罐中法夫酵母JMU-MVP14生物量比7 L罐大幅度提高的原因，根據(jù)這個(gè)規(guī)律，預(yù)計(jì)在生產(chǎn)型的發(fā)酵罐中進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化發(fā)酵，該法夫酵母的生物量及蝦青素產(chǎn)量還將進(jìn)一步提高。

本研究結(jié)果說(shuō)明，用法夫酵母JMU-MVP14進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，可以實(shí)現(xiàn)蝦青素高產(chǎn)發(fā)酵，其產(chǎn)量水平達(dá)到了產(chǎn)業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的要求；同時(shí)，法夫酵母JMU-MVP14菌株還含有大量的其他類(lèi)胡蘿卜素，其發(fā)酵產(chǎn)量可達(dá)300 mg/L以上，可通過(guò)進(jìn)一步研究，將其轉(zhuǎn)化為蝦青素或開(kāi)發(fā)其利用價(jià)值；此外，該法夫酵母還含有豐富的蛋白質(zhì)、糖類(lèi)及脂肪，可從提取蝦青素后的菌體中回收這些成分并加以利用；因此該菌株具有良好的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。

REFERENCES

[1] Johnson EA, An GH. Astaxanthin from microbial sources. Crit Rev Biotechnol, 1991, 11(4): 297?326.

[2] Miki W. Biological functions and activities of animal carotenoids. Pure Appl Chem, 1991, 63(1):141?146.

[3] Bjerkeng B, Peisker M, von Schwartzenberg M, et al. Digestibility and muscle retention of astaxanthin in Atlantic salmon, salmo salar, fed diets with the red yeast Phaffia rhodozyma in comparison with synthetic formulated astaxanthin. Aquaculture, 2007, 269(1/4): 476?489.

[4] Santocono M, Zurria M, Berrettini M, et al. Lutein, zeaxanthin and astaxanthin protect against DNA damage in SK-N-SH human neuroblastoma cells induced by reactive nitrogen species. J Photochem Photobiol B, 2007, 88(1): 1?10.

[5] Andrewes AG, Phaff HJ, Starr MP. Carotenoids of Phaffia rhodozyma, a red-pigmented fermenting yeast. Phytochemistry, 1976, 15(6): 1003?1007.

[6] Johnson EA. Phaffia rhodozyma: colorful odyssey. Int Microbiol, 2003, 6(3): 169?174.

[7] Cannizzaro C, Christensen B, Nielsen J, et al. Metabolic network analysis on Phaffia rhodozyma yeast using13C-labeled glucose and gas chromatography-mass spectrometry. Metab Eng, 2004, 6(4): 340?351.

[8] Chumpolkulwong N, Kakizono T, Nagai S, et al. Increased astaxanthin production by Phaffia rhodozyma mutants isolated as resistant to diphenylamine. J Ferment Bioeng, 1997, 83(5): 429?434.

[9] An GH, Jang BG, Cho MH. Cultivation of the carotenoid-hyperproducing mutant 2A2N of the red yeast Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma) with molasses. J Biosci Bioeng, 2001, 92(2): 121?125.

[10] Sun N, Lee S, Song KB. Characterization of a carotenoid-hyperproducing yeast mutant isolated by low-dose gamma irradiation. Int J Food Microbiol, 2004, 94(3): 263?267.

[11] Johnson EA, Lewis MJ. Astaxanthin formation by the yeast Phaffia rhodozyma. J Gen Microbiol, 1979, 115(1): 173?183.

[12] Liu YS, Wu JY, Ho KP. Characterization of oxygen transfer conditions and their effects on Phaffia rhodozyma growth and carotenoid production in shake-flask cultures. Biochem Eng J, 2006, 27(3): 331?335.

[13] Hu ZC, Zheng YG, Wang Z, et al. pH control strategy in astaxanthin fermentation bioprocess by Xanthophyllomyces dendrorhous. Enzyme Microb Technol, 2006, 39(4): 586?590.

[14] Ni H, Chen QH, Ruan H, et al. Studies on optimization of nitrogen sources for astaxanthin production by Phaffia rhodozyma. J Zhejiang Univ Sci B, 2007, 8(5): 365?370.

[15] Wang WJ, Yu LJ, Zhou PP. Effects of different fungal elicitors on growth, total carotenoids and astaxanthin formation by Xanthophyllomyces dendrorhous. Bioresour Technol, 2006, 97(1): 26?31.

[16] Flores-Cotera LB, Martín R, Sánchez S. Citrate, a possible precursor of astaxanthin in Phaffia rhodozyma: influence of varying levels of ammonium, phosphate and citrate in a chemically defined medium. Appl Microbiol Biotechnol, 2001, 55(3): 341?347.

[17] Ni H, Chen QH, He GQ, et al. Optimization of acidic extraction of astaxanthin from Phaffia rhodozyma. J Zhejiang Univ Sci B, 2008, 9(1): 51?59.

[18] Xiao AF, Ni H, Cai HN, et al. An improved process for cell disruption and astaxanthin extraction from Phaffia rhodozyma. World J Microbiol Biotechnol, 2009, 25(11): 2029?2034.

[19] Ni H, Xiao AF, Li LJ, et al. Studies on cultivation of Phaffia rhodozyma for producing astaxanthin with starch syrup as carbon source. J Chin Ins Food Sci Technol, 2009, 9(1): 29?34.倪輝, 肖安風(fēng), 李利君, 等. 利用淀粉糖作碳源培養(yǎng)法夫酵母生產(chǎn)蝦青素的研究. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2009, 9(1): 29?34.

[20] Luna-Flores CH, Ramírez-Cordova JJ, Pelayo-Ortiz C, et al. Batch and fed-batch modeling of carotenoids production by Xanthophyllomyces dendrorhous using Yucca fillifera date juice as substrate. Biochem Eng J, 2010, 53(1): 131?136.

[21] álvarez V, Rodríguez-Sáiz M, de la Fuente JL, et al. The crtS gene of Xanthophyllomyces dendrorhous encodes a novel cytochrome-P450 hydroxylase involved in the conversion of β-carotene into astaxanthin and other xanthophylls. Fungal Genet Biol, 2006, 43(4): 261?272.

[22] Ni H. Optimization of Phaffia rhodozyma cultivation condition, astaxanthin extraction and analysis [D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2005.倪輝. 法夫酵母蝦青素發(fā)酵條件的優(yōu)化及提取與分析研究[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2005.

[23] Zhang LX, Zhang TF, Li LY. Biochemistry Experiment Method and Technology. 2nd ed. Beijing: Higher Education Press, 1997.張龍翔, 張庭芳, 李令媛. 生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù). 2版.北京: 高等教育出版社, 1997.

[24] AOAC. Horwitz W, ed. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists. 15th ed. Washington D.C.: American Public Health Association, 1990.

[25] Meyer PS, Preez JC, Kilian SG. Selection and evaluation of astaxanthin-overproducing mutants of Phaffia rhodozyma. World J Microbiol Biotechnol, 1993, 9(5): 514?520.

[26] An GH, Suh OS, Kwon HC, et al. Quantification of carotenoids in cells of Phaffia rhodozyma by autofluorescence. Biotechnol Lett, 2000, 22(12): 1031?1034.

[27] Vázquez M, Martin AM. Mathematical model for Phaffia rhodozyma growth using peat hydrolysates as substrate. J Sci Food Agric, 1998, 76(4): 481?487.

[28] Kusdiyantini E, Gaudin P, Goma G, et al. Growth kinetics and astaxanthin production of Phaffia rhodozyma on glycerol as a carbon source during batch fermentation. Biotechnol Lett, 1998, 20(10): 929?934.

[29] Reynders MB. Studies of growth, modelling and pigment production by the yeast Phaffia rhodozyma [D]. Rondebosch: University of Cape Town, 1995.

[30] Liang XL. Biosynthesis of astaxanthin by the yeast Phaffia rhodozyma[D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2001.梁新樂(lè). 法夫酵母生物合成蝦青素的研究[D]. 杭州:浙江大學(xué), 2001.