姚璐曄，丁海洋，倪歆晨，朱 婧，孫鳳丹，冀 宏

（常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500）

“同工酶”一詞首先由Moller和Markert于1959年提出[1].同工酶結(jié)構(gòu)的相似性反映了生物間的親緣關(guān)系，因此同工酶分析可用于種和種以下的分類，酶譜資料可作為鑒定物種，研究分類、進(jìn)化、遺傳與變異的重要指標(biāo)[2-5].目前在食用菌研究中應(yīng)用較多的同工酶是酯酶同工酶和過(guò)氧化物同工酶.其中關(guān)于酯酶同工酶技術(shù)的研究已屢有報(bào)道[6-11]．

在研究中發(fā)現(xiàn)，一般按照中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《食用菌菌種真實(shí)性鑒定酯酶同工酶電泳法》進(jìn)行制膠、樣品處理、電泳等操作，發(fā)現(xiàn)在現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室條件下其實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不理想，如膠長(zhǎng)時(shí)間不凝、平行實(shí)驗(yàn)電泳時(shí)間差異大、染色效果差等.為此，本文以杏鮑菇為對(duì)象，針對(duì)凝膠配制、樣品處理、電泳等環(huán)節(jié)進(jìn)行方法改進(jìn)，摸索出適合實(shí)驗(yàn)教學(xué)的食用菌酯酶同工酶電泳技術(shù)．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

杏鮑菇：江蘇昆山正興食用菌有限公司提供的光滑（R）型和粗糙（S）型兩種杏鮑菇，由實(shí)驗(yàn)人員將其組織分離后接種于斜面．

1.2 培養(yǎng)基[12]

固體培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基）：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2%，水1L．

液體培養(yǎng)基：葡萄糖2%，玉米粉1%，豆粕1%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.1%，牛肉膏0.5%，硫胺素200～400mg，水1L．

1.3 主要試劑

（1）樣品提取液（pH7.5）：稱取6.02g磷酸氫二鈉，0.5g磷酸二氫鈉，溶于水，稀釋至100mL．

（2）過(guò)硫酸銨溶液：1.4g/L過(guò)硫酸銨溶于水中，并稀釋至100mL，用時(shí)現(xiàn)配．

（3）40%（W/V）的蔗糖溶液：稱取40g蔗糖，溶于水中，定容至100mL．

（4）分離膠緩沖液（pH8.9）：36.6g三羥甲基甲烷（Tris），48mL 1mol/L的鹽酸，加TEMED 0.23mL，加蒸餾水定容至100mL，4℃貯藏．

（5）濃縮膠緩沖液（pH6.7）：5.98g Tris，48mL 1mol/L的鹽酸，加TEMED 0.46mL，加蒸餾水定容至100mL，4℃貯藏．

（6）分離膠母液（7%）：28.0g丙烯酰胺（Acr），0.735g甲叉雙丙烯酰胺（Bis），溶于水中，并稀釋至100mL，用棕色瓶4℃貯藏．

（7）濃縮膠母液（2.5%）：10.0g Acr，2.5g Bis，溶于水中，并稀釋至100mL，用棕色瓶4℃貯藏．（8）電極緩沖液（pH8.3）：6.0g Tris，28.8g甘氨酸，溶于水，稀釋至1L，用時(shí)稀釋10倍．

（9）磷酸緩沖液（pH6.5）：稱取2.26g磷酸氫二鈉，2.14g磷酸二氫鈉溶于水中，稀釋至100mL．

（10）染色液：稱取50mg乙酸-1-奈酯，50mg乙酸-2-萘酯，100mg固藍(lán)RR鹽，用5mL丙酮溶解，再加入磷酸緩沖液（pH6.5）150mL，過(guò)濾．

（11）乙酸溶液（70mL/L）：量取14mL乙酸加到適量水中，稀釋至200mL．

（12）溴酚藍(lán)指示劑：稱取溴酚藍(lán)0.1g，加0.05mol/L氫氧化鈉溶液3.0mL使之溶解，用水稀釋至100mL．

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

（1）液體搖瓶培養(yǎng)[12]

采用液體培養(yǎng)基，滅菌，無(wú)菌條件下接種3～4塊0.5cm3的菌塊至液體培養(yǎng)基中，28℃靜置培養(yǎng)24h后置于恒溫振蕩搖床上，28℃150rpm培養(yǎng)7d．

（2）樣品制備[8]

收集液體深層發(fā)酵產(chǎn)生的菌絲球，稱取0.5g菌絲球，置于研缽，加0.5g石英砂，1mL樣品提取液，冰浴研磨，將樣品收集于1.5mL離心管中，4℃，10000rpm離心5min，取上清液.將上清液、蔗糖溶液、溴酚藍(lán)溶液按（V:V:V）5:1:1的比例混合，混合液即為電泳樣品．

（3）凝膠制備[8]

分離膠：將分離膠緩沖液、分離膠母液、蒸餾水、過(guò)硫酸銨按體積比為1:2:1:4混合，攪拌均勻，加入電泳槽中直至距短板3cm處，封上適量蒸餾水，待凝．

濃縮膠：待分離膠凝固后，棄去上部的蒸餾水，將濃縮膠緩沖液、濃縮膠母液、核黃素、蔗糖溶液按照體積比為1:2:1:4的比例混合，攪拌均勻，灌入膠室，立即插好樣品梳，日光或燈光下聚合．

（4）加樣

濃縮膠聚合后，小心抽出樣品梳，吸取加樣孔中多余的水分，在電泳槽中加入電極緩沖液，用微量進(jìn)樣器吸取適量樣品加入樣品孔中．

（5）染色

將取出的凝膠浸沒(méi)于染色液中，37℃染色15～30min，用蒸餾水沖洗數(shù)次后置于乙酸溶液中固定．

2 結(jié)果與分析

2.1 濃縮膠配方的優(yōu)化

根據(jù)《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》中食用菌菌種真實(shí)性鑒定酯酶同工酶電泳法中分離膠、濃縮膠的配方制膠，該配方濃度為7%，適于食用菌酯酶的分子量.預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，將分離膠灌入膠室，水封后，將制膠器放入60℃烘箱中，可加速分離膠的凝固，且制成的膠柔韌性和剛性較好；分離膠的凝固時(shí)間約為70min．

原配方的濃縮膠采用光聚合催化，不易凝固.為此，將光聚合改為化學(xué)聚合，即將濃縮膠中的核黃素改成過(guò)硫酸銨溶液（AP），并引進(jìn)了四甲基乙二胺（TEMED）．

如表1所示，對(duì)照組即原始配方，放置過(guò)夜不凝，可能光照強(qiáng)度不夠，以致沒(méi)有足夠的自由基參與膠的凝固.實(shí)驗(yàn)組均采用化學(xué)聚合的催化方法，引進(jìn)AP和TEMED，膠得以凝固；隨著兩者量的逐步遞增，在不影響濃縮膠質(zhì)量的前提下，膠的凝固時(shí)間控制在80min左右，達(dá)到了預(yù)期目標(biāo)．

濃縮膠初始配方的膠濃度是2.5%，膠濃度很低，凝膠孔徑大，剛性差，當(dāng)加樣梳拔去時(shí)，加樣孔變形，無(wú)法加樣.針對(duì)此問(wèn)題，采用提高蔗糖量的方法解決.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)蔗糖的量提高到5mL時(shí)，膠的剛性有了顯著改變，繼續(xù)提高蔗糖的量，濃縮膠不凝，這是因?yàn)榧哟笳崽橇康耐瑫r(shí)，也加大了濃縮膠的總體積，濃縮膠母液的比例在逐漸降低，因此當(dāng)再加大蔗糖量時(shí)，濃縮膠因其膠濃度低而無(wú)法凝固．

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，最終確定濃縮膠的配方為：濃縮膠緩沖液1mL，濃縮膠母液2mL，過(guò)硫酸銨溶液（AP）2mL，蔗糖溶液5mL，四甲基乙二胺（TEMED）50uL．

因?yàn)闈饪s膠的膠濃度較低，分離膠上部及梳子帶有的少量水都能影響到濃縮膠的凝固，使?jié)饪s膠的凝固時(shí)間不固定，隨機(jī)性很大.為此，通過(guò)變換不同的實(shí)驗(yàn)方法，最終采用在分離膠凝固之后，用濃縮膠緩沖液潤(rùn)洗分離膠上部，梳子在使用前烘干的措施，以減少水分的帶入，使?jié)饪s膠的凝固時(shí)間基本穩(wěn)定為80min．

同灌注分離膠類似，當(dāng)濃縮膠灌注結(jié)束，插入加樣梳后，同樣將制膠器放入60℃的烘箱中，為了防止?jié)饪s膠中水分的蒸發(fā)，導(dǎo)致上層濃縮膠凝固后不平整，故在放入烘箱前用保鮮膜將其頂部裹?。?/p>

表1 濃縮膠配方改進(jìn)方案

2.2 電泳時(shí)間考察

根據(jù)優(yōu)化后的凝膠配方制成相應(yīng)的分離膠及濃縮膠，在濃縮膠聚合后，加樣，電泳.樣品在濃縮膠中耗時(shí)75min～90min；進(jìn)入分離膠時(shí)，所有樣品都?jí)嚎s成極細(xì)的條帶，濃縮效應(yīng)顯著；樣品從進(jìn)入分離膠，至溴酚藍(lán)指示劑下移至距膠底約1cm時(shí)停止電泳，耗時(shí)150min～180min；整個(gè)過(guò)程耗時(shí)近四小時(shí).經(jīng)取膠染色后發(fā)現(xiàn)，酶帶均分布在分離膠的上部，且離濃縮膠較近；由于濃縮膠比較軟，在取膠時(shí)，濃縮膠已破壞，所以分布在分離膠上端的酶帶容易在取膠時(shí)被破壞.因此，將停止電泳的時(shí)間再延長(zhǎng)半小時(shí)，即溴酚藍(lán)指示劑下移至距膠底約1cm時(shí)再通電半小時(shí).結(jié)果如圖1所示，各酶帶間的相互距離不發(fā)生變化，僅使所有條帶均往下移動(dòng)，條帶更清晰，電泳圖更美觀；且移動(dòng)最快的酶帶也未移出凝膠.若涉及到遷移率的計(jì)算，應(yīng)將公式中溴酚藍(lán)的遷移距離改為分離膠的長(zhǎng)度，此項(xiàng)變動(dòng)不會(huì)影響酶帶遷移率的分析．

2.3 樣品處理

本實(shí)驗(yàn)采用的是冰浴研磨法，根據(jù)資料處理樣品，進(jìn)行電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶帶顏色較淺，說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)中的液體培養(yǎng)基進(jìn)行菌絲培養(yǎng)，最終菌絲球中含有的酯酶酶量少.在此基礎(chǔ)上，考察了不同菌絲體及樣品提取液的配比：分別用1mL樣品提取液處理0.5g菌絲、1g菌絲、1.5g菌絲及2g菌絲.隨著處理菌絲量的增加，加入石英砂的量也相應(yīng)增加，以保證研磨徹底.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在同一電泳條件下，用1mL樣品提取液處理1.5g菌絲，此時(shí)酶帶較清晰.盡管在此基礎(chǔ)上增加菌絲的量，酶帶清晰度會(huì)有小幅度的提高，但考慮到后續(xù)實(shí)驗(yàn)中菌絲的生成量，故最終將兩者的配比定為1.5g菌絲體用1mL樣品提取液處理．

圖1 不同電泳時(shí)間下酶帶的分布位置(a圖為指示劑移至距膠底1cm時(shí)停止電泳，b圖為在a圖上再延長(zhǎng)半小時(shí))

其次，樣品離心后的上清液與蔗糖溶液、溴酚藍(lán)指示劑的比例也由原來(lái)的5:1:1改為8:3:1，總體積1.2mL不發(fā)生變化，這樣，同樣的樣品加樣量中所含的酯酶同工酶的量就得以提高，蔗糖溶液含量幾乎未變，而溴酚藍(lán)指示劑含量的變低，僅僅表現(xiàn)在指示劑顏色變淺，對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有影響．

圖2 杏鮑菇酯酶同工酶不同加樣量電泳圖(a、b、c圖分別為1mL樣品液處理0.5g菌絲、1g菌絲和1.5g菌絲)

2.4 電泳

在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行電泳．

分離膠配方（7%）：分離膠緩沖液3mL，分離膠母液6mL，水3mL，過(guò)硫酸銨溶液12mL．

濃縮膠配方（2.5%）：濃縮膠緩沖液1mL，濃縮膠母液2mL，過(guò)硫酸銨溶液2mL，蔗糖溶液5mL，四甲基乙二銨50uL．

樣品處理：1mL樣品提取液加至含有1.5g菌絲球及石英砂的研缽，冰浴研磨，離心；離心上清液與蔗糖溶液、溴酚藍(lán)指示劑的比例為8:3:1．

電泳：穩(wěn)流電泳.樣品在濃縮膠的電流為10mA，進(jìn)入分離膠后升至15mA，溴酚藍(lán)指示劑距膠底1cm處時(shí)再通電30min后停止電泳．

結(jié)果見(jiàn)圖3，從圖中可以看出，樣品（杏鮑菇）酶帶清晰，且實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性好；膠兩側(cè)與中間的樣品條帶區(qū)別不大，幾乎沒(méi)有燒膠等現(xiàn)象．

為了進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所得酯酶同工酶電泳技術(shù)在本實(shí)驗(yàn)室條件下的應(yīng)用，對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間的杏鮑菇樣品進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖4（S型）和圖5（R型）.從圖中可以看出，電泳的酶帶清晰，結(jié)果明顯，利于分析；杏鮑菇S型的電泳酶帶有6條，R型的酶帶有4條；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，酶帶顏色逐漸加深，說(shuō)明菌絲體培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，生成的酯酶同工酶的酶量越多[9]．

圖3 杏鮑菇酯酶同工酶電泳圖

圖4 杏鮑菇（S型）酯酶同工酶電泳圖從圖的右側(cè)往左側(cè)菌絲體培養(yǎng)時(shí)間依次延長(zhǎng)24h，最右邊的樣品培養(yǎng)時(shí)間為2d，最左邊的樣品培養(yǎng)時(shí)間為10d．

3 結(jié)論

通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定了適合本實(shí)驗(yàn)室條件的食用菌酯酶同工酶電泳技術(shù)，其電泳結(jié)果中酶帶清晰，宜于分析.具體如下：分離膠配方（7%）：分離膠緩沖液3mL，分離膠母液6mL，水3mL，過(guò)硫酸銨溶液12mL.濃縮膠配方（2.5%）：濃縮膠緩沖液1mL，濃縮膠母液2mL，過(guò)硫酸銨溶液2mL，蔗糖溶液5mL，四甲基乙二銨50uL.樣品處理：1mL樣品提取液加至含有1.5g菌絲球及石英砂的研缽，冰浴研磨，離心；離心上清液與蔗糖溶液、溴酚藍(lán)指示劑的比例為8:3:1.電泳：穩(wěn)流電泳.樣品在濃縮膠的電流為10mA，進(jìn)入分離膠后升至15mA，溴酚藍(lán)指示劑距膠底1cm處時(shí)再通電30min后停止電泳．

圖5 杏鮑菇（R型）酯酶同工酶電泳圖從圖的左側(cè)往右側(cè)菌絲體培養(yǎng)時(shí)間依次延長(zhǎng)24h，從左至右，第一個(gè)樣品培養(yǎng)時(shí)間為2d，最后一個(gè)樣品培養(yǎng)時(shí)間為10d．

將已確定的電泳技術(shù)分析實(shí)驗(yàn)菌株杏鮑菇S型和R型的不同培養(yǎng)周期的酯酶同工酶條帶，結(jié)果表明，在培養(yǎng)的10d時(shí)間內(nèi)，S型共出現(xiàn)6條條帶，R型出現(xiàn)了4條；隨著培養(yǎng)周期的延長(zhǎng)，酶帶顏色逐步加深，表明酶量增加，但酶帶的數(shù)目并無(wú)變化.本實(shí)驗(yàn)對(duì)食用菌酯酶同工酶的相關(guān)研究具有一定的參考價(jià)值．

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