吳 敏，王星果，張 營(yíng)，徐建榮，顧志良

（常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500）

鳡(Elopichthys bambusa)屬于鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、雅羅魚亞科(Leuciscinae)、鳡屬.主要分布于我國(guó)長(zhǎng)江中下游的江河湖泊中，為大型經(jīng)濟(jì)魚類之一[1].鳡性猛貪婪，是兇猛的肉食性魚類，在保持水體生態(tài)平衡中起著重要作用；又因其肉質(zhì)鮮美，被列入大型上等食用魚類[2].近年來因環(huán)境惡化和過度捕撈等因素，鳡資源遭到了嚴(yán)重的破壞，種群數(shù)量急劇下降，已被列入國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)瀕危及受威脅水生物種名錄[3]．

魚類線粒體DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）同其他脊椎動(dòng)物的線粒體DNA一樣，是細(xì)胞質(zhì)中具自主復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯能力的共價(jià)閉合環(huán)狀雙鏈DNA，包括一條重鏈和一條輕鏈[4].魚類線粒體DNA具有分子小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、重組率低、進(jìn)化速度快、不同區(qū)域進(jìn)化速度存在差異等特點(diǎn)，是魚類進(jìn)化遺傳學(xué)、分子生態(tài)學(xué)、遺傳多樣性及其保護(hù)生物學(xué)等研究的重要標(biāo)記[5].在NADH氧化還原酶基因中，ND5基因進(jìn)化速度相當(dāng)快，是作為相關(guān)種群系統(tǒng)發(fā)育研究最有用的基因之一[6].ND5基因在昆蟲的分子系統(tǒng)學(xué)中研究較多，葉維萍等[7]對(duì)中國(guó)飛蝗3亞種的線粒體12S rDNA（487 bp）和ND5（451 bp）基因的部分序列進(jìn)行測(cè)定，與已知線粒體基因組全序列的非洲飛蝗亞種進(jìn)行序列比較，并對(duì)ND5基因以斑腿蝗科瘤喉蝗為外群重建最簡(jiǎn)約樹，以研究它們的生物地理關(guān)系．

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)鳡的繁殖、養(yǎng)殖等研究較多，而對(duì)其在基因水平上的研究很少.基因庫(kù)中目前尚未有鳡線粒體ND5基因序列的報(bào)道.本研究利用相應(yīng)的引物對(duì)鳡線粒體ND5基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增并克隆測(cè)序，獲得了ND5基因全序列，并對(duì)ND5基因進(jìn)行堿基組成及密碼子使用情況分析，還對(duì)ND5基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析.研究結(jié)果將為魚類其它物種的系統(tǒng)分類提供參照，又可為鳡的系統(tǒng)分類提供分子水平的證據(jù)，同時(shí)也可為今后鳡的資源保護(hù)、開發(fā)和養(yǎng)殖提供相應(yīng)的理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物長(zhǎng)江鳡魚來源于蘇州市長(zhǎng)江特色水產(chǎn)繁殖工程中心，活魚宰殺后，采集其肌肉組織存放于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?用常規(guī)苯酚-氯仿法提取鳡基因組DNA．

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的鯉魚和斑馬魚等其他魚類線粒體基因組ND5基因側(cè)翼序列信息設(shè)計(jì)引物Gynd4F2：5-TATCCTAGCACTATGAGGTG-3，Gynd6R4：5-TGGCTGAGGATAGGGTTAAG-3.引物由上海生工生物工程有限公司合成．

1.3 ND5基因的PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增在25μL反應(yīng)體系中進(jìn)行：0.2μL ExTaq 酶（5U·μL-1，TaKaRa Tokyo，Japan），2.5μL 10×PCR ExTaq Buffer（with Mg2+），2μL dNTP（2.5 mmol·L-1each），上、下游引物各1μL（10μM），DNA模板（100ng/μL）1 μL，加滅菌水至25μL.PCR擴(kuò)增條件為95℃變性3min；95℃ 30 Sec，60℃30Sec，72℃2min 30Sec，30次循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存．

1.4 ND5基因的克隆與測(cè)序

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳，并切膠回收目的片段.將回收片段克隆到pMD18-T Vector（TaKaRa大連生物公司）中，挑取陽(yáng)性菌落，于LB液體培養(yǎng)基Amp+中搖菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，經(jīng)鑒定后將重組質(zhì)粒送往上海桑尼生物科技公司進(jìn)行測(cè)序．

1.5 數(shù)據(jù)分析

用DNAMAN軟件，將測(cè)得鳡ND5基因序列與參照物種ND5基因序列比對(duì)，得到它們同源性的遠(yuǎn)近.利用Clustalx軟件，對(duì)鳡和參照物種ND5基因序列進(jìn)行比對(duì)，利用MEGA 4.0軟件，用NJ法構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹.

2 結(jié)果與分析

2.1 鳡ND5基因的PCR擴(kuò)增

采用引物Gynd4F2/Gynd6R4，擴(kuò)增鳡ND5基因.擴(kuò)增得到一條特異性的條帶，片段長(zhǎng)度在2200bp左右，與預(yù)期結(jié)果相符（圖1）．

圖1 PCR擴(kuò)增鳡線粒體ND5基因片段M：DL-2000分子量標(biāo)記1.擴(kuò)增片段M：DL-2000 Marker 1、PCR amplification fragment

2.2 鳡ND5基因的序列組成

將上述擴(kuò)增片段克隆后進(jìn)行測(cè)序，得到鳡ND5基因序列全長(zhǎng)為1836bp（GenBank登錄號(hào)：HQ844003），見圖2.四堿基含量分別為T29.6%，C26.0%，A32.9%，G11.4%，A+T含量為62.5%；密碼子第三位上堿基含量為T26.8%，C27.9%，A42.6%，G2.6%，A+T含量為69.4%，見表1.比較ND5基因總的堿基組成和密碼子第三位點(diǎn)的堿基組成，發(fā)現(xiàn)兩者都富含A、T，G、C含量較低，且存在反G偏倚.比較ND5基因密碼子三個(gè)位點(diǎn)的堿基組成，發(fā)現(xiàn)第一位點(diǎn)各堿基使用較為平均，沒有明顯的偏倚；第二位點(diǎn)富含T，含量為41.5%，存在一定的反G偏倚；第三位點(diǎn)A含量最高，為42.6%，有明顯的反G偏倚，含量?jī)H為2.6%．

將鳡ND5基因核酸序列翻譯成氨基酸序列時(shí)，密碼子的使用情況如表2所示.在所有的密碼子中，UGG、CGU、CUG、CCG、CGG、AGA、AGG、GCG沒有使用到.使用頻率最高的是AUU（40.0%），其次是CUA（38.0%）；除終止密碼子外，使用頻率最低的是UUG、UCG、CGC、ACG、AAG、GUG、GAG、GGG（均為1.0%）．

表1 鳡ND5基因及其密碼子各位置的堿基組成及含量(%)

鳡ND5基因編碼611個(gè)氨基酸殘基的多肽，氨基酸序列見圖2.其中含量最高為L(zhǎng)eu(15.55%)，含量最低的是Cys（0.82%），見表3．

2.3 鳡ND5基因與其他物種的同源性比較

利用DNAMAN軟件，將鳡ND5基因DNA序列和氨基酸序列與草魚、鯽魚、劍尾魚、鯉魚、鰱魚、翹嘴鲌、青魚、團(tuán)頭魴、鱘魚、鼠10個(gè)物種分別進(jìn)行比對(duì)，得到鳡與其他物種的同源性系數(shù)，結(jié)果見表4.從表中可知，鳡魚與鰱魚的堿基同源性最高（85.93%），其次是青魚，同源性為85.88%，鳡與鼠的堿基同源性最低，只有64.10%．除劍尾魚與鼠之外，鳡與其他幾個(gè)物種的氨基酸同源性都較高．

2.4 不同物種間的遺傳距離

利用MEGA4.0軟件計(jì)算出各個(gè)物種間的遺傳距離，結(jié)果見表5.由表可知，鳡與鰱魚之間的遺傳距離最小，為0.135，其次是青魚，為0.139.與鼠的遺傳距離最大，為0.488.物種間兩兩比較的遺傳距離中，鰱魚和青魚的遺傳距離最小，為0.102．

2.5 基于ND5基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

利用Clustalx軟件，將鳡ND5基因與其他10個(gè)物種進(jìn)行比對(duì)，再用MEGA 4.0軟件中的NJ法構(gòu)建分子進(jìn)化樹.結(jié)果如圖3所示，以鼠為外群，其余10個(gè)物種為內(nèi)群，從所構(gòu)建的系統(tǒng)樹可以看出，內(nèi)群的10個(gè)物種分為2個(gè)支系，第1支系只有劍尾魚；第2支系由翹嘴鲌、團(tuán)頭魴、青魚、草魚、鰱魚、鳡魚、鯽魚、鯉魚、鱘魚組成，其中前8種魚類都屬鯉形目鯉科，鱘魚屬鱘形目鱘科.在第2支系中，翹嘴鲌與團(tuán)頭魴先聚為姊妹群，BCL值為93%，然后與青魚聚合，BCL值為50%，再與草魚聚合，BCL值為84%，而后與鰱魚聚合，BCL值為92%，最后與鳡聚合，BCL值為 100%；鯽魚與鯉魚聚為姊妹群，BCL值為100%；鱘魚獨(dú)立分支出來．

圖2 鳡ND5基因核苷酸和氨基酸序列

表2 鳡ND5基因的密碼子使用情況

續(xù)表

表3 鳡ND5基因編碼的氨基酸含量

3 討論

本文分析了ND5基因的序列特征.比較基因的堿基組成發(fā)現(xiàn)，A+T的含量都大于G+C，表現(xiàn)出AT的相對(duì)豐富以及GC的相對(duì)缺乏，符合動(dòng)物線粒體基因組的堿基組成特點(diǎn)[8].比較基因密碼子三個(gè)位置堿基組成發(fā)現(xiàn)，第二位上堿基都存在T偏倚和反G偏倚，第三位存在明顯的反G偏倚，說明這兩個(gè)位點(diǎn)對(duì)核苷酸有偏好使用.在脊椎動(dòng)物中，第三位的反G偏倚主要是因?yàn)樵撐稽c(diǎn)的堿基在進(jìn)化上選擇壓力比其他兩個(gè)位點(diǎn)小[9]．

表4 鳡與其他物種ND5基因同源性比較

表5 不同物種ND5基因間的遺傳距離

從表5的遺傳距離可以看出，鳡與鰱魚的遺傳距離最?。?.135），其次是青魚（0.139），這與形態(tài)學(xué)上的分類[10]不盡一致.形態(tài)學(xué)上這三者同屬鯉形目鯉科，鳡魚和青魚同屬雅羅魚亞科，而鰱魚屬于鰱亞科、鰱屬．

系統(tǒng)發(fā)生樹分支大體：嚙齒目小鼠作為外群，內(nèi)群分為兩支，銀漢魚目劍尾魚為獨(dú)立的一支；另一支包括鯉形目鯉科的翹嘴鲌、團(tuán)頭魴、青魚、草魚、鰱魚、鳡魚、鯽魚、鯉魚，鱘形目鱘科的鱘魚獨(dú)立分支出來，表明鯉形目和鱘形目親緣關(guān)系較近，而銀漢魚目與它們的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，與形態(tài)學(xué)分類一致；鯉科的幾種魚類又可分為兩支，翹嘴鲌、團(tuán)頭魴（鲌亞科）、青魚、草魚、鳡魚（雅羅魚亞科）、鰱魚（鰱亞科）為一支，鯽魚和鯉魚（鯉亞科）聚為姊妹群，為另一支，表明雅羅魚亞科、鲌亞科和鰱亞科之間的親緣關(guān)系很近，而鯉亞科與它們的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)．

系統(tǒng)發(fā)生樹結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類也不完全一致，可能因?yàn)镹D5基因的進(jìn)化速度比較快，用于科屬間的親緣關(guān)系比較可能存在一定的誤差，在進(jìn)一步的研究中將結(jié)合其他線粒體基因作為遺傳標(biāo)記，以獲得更加客觀的系統(tǒng)分類．

圖3 由鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹（基于ND5基因序列）

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