任昊，翟效月

（中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，沈陽 110001）

血紅素氧合酶在腦膜炎中的差異性表達(dá)及SnPP的保護(hù)作用

任昊，翟效月

（中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，沈陽 110001）

目的研究血紅素氧合酶（HO）在腦膜炎大腦中的改變及其與游離鐵增加的內(nèi)在關(guān)聯(lián)，探討錫原卟啉對(duì)腦源性游離鐵增加的抑制作用。方法 利用新生Wistar大鼠制作腦膜炎動(dòng)物模型。采用免疫熒光組織化學(xué)檢測(cè)血紅素氧合酶1和2在大腦中的表達(dá)及其產(chǎn)物膽紅素的分布。采用免疫印跡方法對(duì)血紅素氧合酶1和2進(jìn)行定量分析。錫原卟啉皮下注射后利用Ferene-S方法檢測(cè)腦內(nèi)游離鐵含量變化。結(jié)果 與對(duì)照組相比，HO-1蛋白水平在感染組中顯著上升，且與腦游離鐵有共存關(guān)系，HO-2表達(dá)水平低且保持恒定。錫原卟啉抑制HO-1產(chǎn)物膽紅素的產(chǎn)生和游離鐵增加。結(jié)論大鼠腦膜炎病變過程中腦游離鐵的增加是腦源性的，由HO-1分解血紅素產(chǎn)生。錫原卟啉能夠顯著抑制血紅素氧合酶活性，從而抑制腦膜炎病變過程中游離鐵的產(chǎn)生。

大鼠；游離鐵；血紅素氧合酶；錫原卟啉

細(xì)菌性腦膜炎是威脅發(fā)展中國家嬰幼兒生命的重大疾病之一［1］。鐵是大腦內(nèi)含量最高的金屬元素，參與能量代謝、髓鞘合成等各種生理過程。但是作為一種可變價(jià)的過渡金屬元素，鐵也能夠通過芬頓化學(xué)反應(yīng)促進(jìn)羥自由基的形成而引起組織過氧化損傷［2］。我們的前期研究表明，某些腦損傷，如實(shí)驗(yàn)性大鼠肺炎球菌性腦膜炎過程中會(huì)釋放出游離鐵，增加了大腦氧化應(yīng)激的風(fēng)險(xiǎn),但該游離鐵的來源尚不清楚［3］。血紅素氧合酶（hemoxygenase，HO）催化降解細(xì)胞內(nèi)的血紅素釋放出游離鐵和膽綠素［4］，膽綠素進(jìn)而被還原生成膽紅素。目前已知的HO有3種：HO-1、HO-2和 HO-3［5］。在大腦中主要是 HO-1和HO-2具有活性。在應(yīng)激條件下，HO的活性會(huì)發(fā)生改變［6］。目前在肺炎球菌引起的腦膜炎大腦中尚未見關(guān)于HO的報(bào)道。錫原卟啉（Sn-protoporphyrin，SnPP）是一種HO的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，能夠顯著抑制酶活性從而阻止游離鐵的產(chǎn)生。本研究探討了HO在腦膜炎大腦中的改變及其與游離鐵增加的內(nèi)在關(guān)聯(lián)，探討錫原卟啉對(duì)腦源性游離鐵增加的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型

生后11d的Wistar大鼠（瑞士伯爾尼大學(xué)動(dòng)物中心）40只，隨機(jī)分為對(duì)照組（n=20）和實(shí)驗(yàn)組（n=20）。5×106/mL肺炎鏈球菌（血清型3）在硬膜下感染動(dòng)物，對(duì)照組用等量生理鹽水。18h后對(duì)仔鼠進(jìn)行臨床分?jǐn)?shù)評(píng)估，未感染鼠棄用。動(dòng)物用戊巴比妥麻醉，冰磷酸鹽緩沖液灌流后解剖大腦，立即液氮凍存用于定量分析的半球。

1.2 藥物SnPP處理和鐵的化學(xué)檢測(cè)

利用二甲基亞砜的水溶液溶解SnPP（1∶1），避光保存。在感染時(shí)每8h按60mg/kg皮下注射SnPP溶液，共3次。對(duì)照組注射等量的二甲基亞砜水溶液。游離鐵的定量測(cè)量應(yīng)用Ferene-S方法［7］，使用商用試劑盒（DiaSys，Holzhelm，德國）。冰凍大腦皮質(zhì)在冰 Tris緩沖液中（100mL，pH 7.4）1∶2.5勻漿，離心。0.25mL上清液與等量Ferene-S溶液在室溫孵育20min后，在595nm處測(cè)定吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算游離鐵含量。

1.3 免疫組織化學(xué)和細(xì)胞組織化學(xué)檢測(cè)

用5%牛血清白蛋白封閉去石蠟切片，與親和純化的兔抗鼠HO-1和HO-2（Stressgen，BC，加拿大）一抗孵育1h（1∶100），免疫反應(yīng)用金屬增強(qiáng)的鏈霉素親和法可視化［8］。膽紅素的免疫組化利用小鼠單克隆抗膽紅素抗體（24G7，Dojindo，日本）。利用鼠單克隆抗體 GFAP（Chem-icon，CA，美國）檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞。一抗分別與Alexa-555標(biāo)記的羊抗鼠二抗（MolecularProbe，OR，美國）進(jìn)行免疫反應(yīng)。小膠質(zhì)細(xì)胞的組織化學(xué)采用經(jīng)典的IB4方法［9］。首先用活性劑TritonX-100（0.4%）在室溫下孵育腦切片48h，然后用溶解在PBS中的FITC標(biāo)記的IB4（10μg/mL）孵育切片2h，由熒光顯微鏡可視化。

1.4 血紅素氧合酶的免疫印跡定量分析

液氮冷凍的大腦皮質(zhì)稱質(zhì)量，按1∶9比例與蛋白酶抑制劑（La Roche，Basel，瑞士）一起勻漿，離心。測(cè)定上清蛋白濃度。20μg蛋白上樣，利用十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（13%）電泳分離。分離的蛋白被轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜，4℃下與HO-1和HO-2一抗（1∶500）進(jìn)行孵育。二抗使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔IgG抗體（1∶10000）。化學(xué)發(fā)光帶可視化后進(jìn)行定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HO-1和HO-2在腦膜炎大腦的分布特征

免疫組化染色結(jié)果表明，正常對(duì)照組大腦皮質(zhì)中HO-1和HO-2信號(hào)較弱。感染腦膜炎后，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組HO-1表達(dá)顯著增強(qiáng)，陽性信號(hào)位于大腦皮質(zhì)細(xì)胞和血管上；HO-2的表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化。見圖1。

2.2 熒光雙標(biāo)定性HO-1陽性的細(xì)胞種類

為了確定HO-1在大腦中是否和游離鐵有共存關(guān)系，我們利用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，大腦皮質(zhì)神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞上有雙染的黃色熒光信號(hào)，表明在這些部位HO-1表達(dá)陽性（圖2A）。在星形膠質(zhì)細(xì)胞上的綠色熒光和HO-1的紅色熒光則無重合（圖2B），說明在星形膠質(zhì)細(xì)胞上無HO-1表達(dá)。

2.3 HO-1和HO-2蛋白表達(dá)的時(shí)程曲線

為了進(jìn)一步觀察游離鐵和2種血紅素氧合酶的相關(guān)性。本研究利用免疫印跡技術(shù)對(duì)HO-1和HO-2進(jìn)行了時(shí)程分析。結(jié)果表明，在大鼠大腦皮質(zhì)中HO-1蛋白水平隨感染時(shí)程而逐步升高，在感染22h后與對(duì)照組形成顯著差異。而HO-2在這個(gè)感染過程中則沒有明顯改變，始終保持在基礎(chǔ)水平。見圖3。

2.4 SnPP對(duì)血紅素氧合酶活性的抑制作用

血紅素氧合酶能夠分解血紅素而釋放出膽紅素和游離鐵，本研究利用原位檢測(cè)膽紅素表達(dá)來確定SnPP對(duì)血紅素氧合酶的抑制作用。結(jié)果顯示，SnPP消除了感染組中由于血紅素氧合酶活性而產(chǎn)生的膽紅素信號(hào)（圖4B，C），這表明SnPP能夠有效抑制該酶活性。

2.5 SnPP對(duì)大腦游離鐵增高的抑制作用

如圖5所示，與對(duì)照組未感染大鼠相比，感染后大鼠大腦游離鐵水平顯著升高，SnPP顯著抑制感染組游離鐵的增加，同時(shí)SnPP對(duì)對(duì)照組游離鐵無影響。

3 討論

我們的前期研究結(jié)果證明，細(xì)菌性腦膜炎的病理過程伴隨著腦游離鐵的增加，但該游離鐵的來源尚不清楚。因此，本研究對(duì)此進(jìn)行了深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病變腦組織鐵的增加是腦源性的，與HO-1的活性有關(guān)。SnPP能夠抑制該游離鐵的增加而保護(hù)大腦免于過氧化損傷。

大腦內(nèi)儲(chǔ)存的鐵包括血紅素結(jié)合鐵和鐵蛋白結(jié)合鐵2種［10］。本研究針對(duì)血紅素結(jié)合鐵進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)血紅素氧合酶的活性顯著增強(qiáng)，HO-1的表達(dá)明顯上調(diào)，而另一種亞型HO-2的表達(dá)則保持不變。通過細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，HO-1的表達(dá)與游離鐵的增加確有共存性，在神經(jīng)元、血管、小膠質(zhì)細(xì)胞上都有陽性表達(dá)，而在星形膠質(zhì)細(xì)胞上呈陰性。進(jìn)一步的定量分析發(fā)現(xiàn)，HO-1和游離鐵的增加在時(shí)程上有相關(guān)性，都是逐漸增高并在22h時(shí)達(dá)高峰（游離鐵資料未顯示）。以上結(jié)果證明，HO-1的酶活性增強(qiáng)是造成腦源性游離鐵增加的原因，而HO-2不參與這一過程。

血紅素氧合酶能夠分解卟啉環(huán)釋放出游離鐵而使游離鐵庫容量增加［11］。SnPP是該酶的一種競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。為了探討SnPP的抑制作用，本研究首先觀察了HO的終產(chǎn)物膽紅素。結(jié)果表明，SnPP能夠有效抑制膽紅素的產(chǎn)生（圖4），繼而證明SnPP對(duì)游離鐵增加的抑制作用確實(shí)是由于抑制了HO的活性。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，大鼠腦膜炎病變過程中腦游離鐵的增加是腦源性的，由HO-1分解血紅素產(chǎn)生。SnPP能夠顯著抑制血紅素氧合酶活性，從而抑制腦膜炎病變過程中游離鐵的產(chǎn)生。SnPP對(duì)大腦過氧化損傷具有潛在的保護(hù)作用，值得我們進(jìn)行更深入的研究。

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（編輯王又冬，英文編輯劉寶林）

The Differiential Expression of Hemoxygenases and the Protection of SnPP in Experimental Meningitis

REN Hao，ZHAI Xiao-yue
（Department of Histology and Embryology，College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo study the relationship between heme degrading enzyme hemoxygenase activity and free iron increase during brain meningitis，and to investigate the protective effect of Sn-protoporphyrin（SnPP）in the inhibition of free iron release.MethodsWistar pups were used for meningitis brain models.Heme oxygenase（HO）-1and-2expression was measured by Western blot quantitatively and immunohistochemistry.SnPP was injected subcutaneously and free iron was measured with Ferene-S method.Bilirubin was detected by immunohistochemical method to examine hemoxygenase activities.ResultsCompared with control group，HO-1level in the infected brain was significantly increased along with the free iron increase.HO-1expression colocalized with free iron in neurons and glial cells.HO-2level remained low and unchanged.SnPP significantly reduced the free iron release and bilirubin formation.ConclusionPneumococcal meningitis was associated with an increase of free iron in the brain which was originated from HO-1activity increase but not HO-2，SnPP was able to prevent the free iron increase and supposed to be brain protective to oxidative damage.

rat；free iron；hemoxygenase；SnPP

R329.1

A

0258-4646（2011）05-0397-04

doiCNKI：21-1227/R.20110523.1816.027

http：//www.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20110523.1816.027.html

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目（200801590016）

任昊（1974-），男，副教授，博士.

翟效月，E-mail：zhaixy@mail.cmu.edu.cn

2010-11-18

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2011-05-1815：25