李良滿，李靜波，朱悅

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1.骨科；2.感染科，沈陽 110001）

草麻黃補(bǔ)體抑制成分在大鼠急性脊髓損傷中的作用

李良滿1，李靜波2，朱悅1

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1.骨科；2.感染科，沈陽 110001）

目的探討草麻黃補(bǔ)體抑制成分在大鼠急性脊髓損傷中的作用。方法 應(yīng)用多步沉淀和薄層層析方法進(jìn)行草麻黃補(bǔ)體抑制成分的提純并進(jìn)行活性鑒定；參照改良的Allen’s重物打擊法制備大鼠脊髓損傷模型；應(yīng)用CH50法測(cè)定血清總補(bǔ)體溶血活性；應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）mRNA的表達(dá)；采用運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電檢測(cè)評(píng)定脊髓損傷后的神經(jīng)功能。結(jié)果 在傷后12h、1d、3d、7d、14d各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組CH50比值和ICAM-1mRNA表達(dá)均低于對(duì)照組（P<0.01）。傷后7d和14d，實(shí)驗(yàn)組脊髓運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位潛伏期和波幅顯著優(yōu)于對(duì)照組（P<0.01）。結(jié)論草麻黃補(bǔ)體抑制成分能夠顯著減輕脊髓損傷后的免疫炎性反應(yīng)，在繼發(fā)性脊髓損傷中起到重要的保護(hù)作用。

草麻黃；脊髓損傷；炎癥；誘發(fā)電位

doiCNKI：21-1227/R.20110523.1816.029

脊髓損傷繼發(fā)性損傷機(jī)制復(fù)雜，目前臨床上還缺乏有效的治療藥物，免疫炎性反應(yīng)是重要損傷機(jī)制之一，脊髓損傷后存在補(bǔ)體系統(tǒng)的激活，并且補(bǔ)體系統(tǒng)激活后產(chǎn)生的活性片斷及最終產(chǎn)物均可引起和加重?fù)p傷組織的免疫炎性反應(yīng)，通過抑制補(bǔ)體系統(tǒng)激活而減輕免疫炎性反應(yīng)有望成為脊髓損傷新的治療策略［1，2］。本研究探討中藥草麻黃（Ephedra sinica，ES）提純的補(bǔ)體抑制成分對(duì)大鼠急性脊髓損傷后免疫炎性反應(yīng)及神經(jīng)功能的影響，為急性脊髓損傷的抗補(bǔ)體治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 草麻黃補(bǔ)體抑制劑的提純

應(yīng)用多步沉淀及薄層層析方法進(jìn)行草麻黃補(bǔ)體抑制成分的提純并進(jìn)行活性鑒定。1kg草麻黃加入pH4.0的蒸餾水10L，煮沸1h，過濾除渣，加入1mol/L NaOH調(diào)整pH值至9.0，室溫?cái)嚢璺跤?h，離心，洗滌沉淀3次，室溫烘干得到棕褐色粗品共18.5g。取3g粗品溶于pH4.0的蒸餾水50mL中，煮沸1h，離心棄上清，溶于pH 9.0的蒸餾水中，調(diào)整pH值至4.0，進(jìn)行薄層層析，分離提取抗補(bǔ)體成分。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及脊髓損傷模型制備

健康SD大鼠50只，SPF級(jí)，雌雄不拘，體質(zhì)量250～300g。采用改良的 Allen’s重物打擊法［3］方法制備大鼠脊髓急性損傷模型，損傷部位為T10節(jié)段。隨機(jī)分為2組，每組25只。實(shí)驗(yàn)組：分脊髓損傷后12h、1d、3d、7d、14d 五個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn) 5只，傷后1h給予提純的補(bǔ)體抑制成分（15mg/kg）溶于5mL生理鹽水，強(qiáng)制灌胃，每日1次。對(duì)照組：時(shí)間點(diǎn)及動(dòng)物數(shù)量同前，以同樣方法給予等量生理鹽水灌胃。

1.3 血清總補(bǔ)體溶血活性測(cè)定

應(yīng)用CH50法進(jìn)行血清總補(bǔ)體溶血活性測(cè)定。在大鼠脊髓損傷前1h、傷后12h及傷后1～14d，尾靜脈抽血0.3mL，離心，取上清，-20℃保存?zhèn)溆?。制?%綿羊紅細(xì)胞懸液，溶血素效價(jià)測(cè)定，制備50%溶血標(biāo)準(zhǔn)管，然后將各濃度梯度反應(yīng)體系置于微量板孔中，反應(yīng)完畢后在541nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，計(jì)算待測(cè)血清的CH50值并與損傷前血清樣品的基礎(chǔ)值比較，計(jì)算百分比值。

1.4 細(xì)胞間黏附分子1（intercellular adhesive molecule-1，ICAM-1）mRNA 的檢測(cè)

應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR方法檢測(cè)損傷組織中ICAM-1mRNA的表達(dá)。2組動(dòng)物于傷后每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取5只再次麻醉，以傷處T10為中心取約100mg脊髓損傷組織，應(yīng)用Trizol法提取總RNA，并進(jìn)行RNA純度及濃度檢測(cè)，逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成，應(yīng)用Premier 5.0設(shè)計(jì)引物序列。以管家基因GAPDH作為內(nèi)參。操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。ICAM-1正義引物：5′-TGCC TACCCTCCCACAACAG-3′，反義引物 5′-ATACTATG TGGACGAGCATGT-3′，320bp；GAPDH 正義引物：5′-AGTTCAACGGCACAGTCAAGG-3′，反義引物5′-AGACTCCACGACATACTCAGC-3′，283bp。應(yīng)用LightCyclerⅡPCR檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，繪制融解曲線，PCR專用分析軟件根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每個(gè)樣本原始拷貝數(shù)，然后計(jì)算樣品基因校正后的相對(duì)含量。

1.5 運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位檢測(cè)

參照Lee［4］的方法檢測(cè)脊髓運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位（motor evoked potential，MEP），各組大鼠分別于脊髓損傷前 0.5h 及傷后 12h、1d、3d、7d、14d 行 MEP 檢測(cè)，檢測(cè)在銅網(wǎng)屏蔽下進(jìn)行。大鼠麻醉后，將刺激電極陰極刺于T5～6間隙、陽極刺于T7～8間隙，刺激類型為方波脈沖電流，波寬0.1ms，強(qiáng)度100～150mV，濾波帶通過2Hz～10kHz。電位記錄儀采集信號(hào)并貯存，專用軟件分析和測(cè)量其潛伏期（latency，LT）和波幅（amplitude，AM）。將損傷前MEP的測(cè)量值作為基礎(chǔ)值，以百分比表示損傷前后的電位變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血清CH50測(cè)定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組傷后早期血清CH50比值迅速下降，約在傷后1d達(dá)到最低值，分別29.05%±2.08%和24.08%±2.31%；傷后3～7d快速上升，以后緩慢回升，傷后14d對(duì)照組CH50接近傷前水平（98.21%±1.12%），而實(shí)驗(yàn)組僅達(dá)到傷前的75%左右。傷后12h及傷后1～14d各個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組的CH50比值均低于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。

2.2 ICAM-1mRNA檢測(cè)結(jié)果

脊髓損傷后，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組ICAM-1mRNA相對(duì)含量開始升高，約在傷后3d達(dá)到高峰，之后開始逐漸下降，存在一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過程。傷后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組ICAM-1mRNA相對(duì)含量均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見圖1。

2.3 MEP檢測(cè)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組在傷后早期AM值快速下降，僅達(dá)傷前正常值的15%左右，而且LT值明顯延長(zhǎng)，較傷前正常值延長(zhǎng)約30%。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，AM值開始快速回升，LT值亦逐漸縮短。傷后14d，對(duì)照組AM值回升到傷前正常值的73%，實(shí)驗(yàn)組AM值回升到了80%，2組的LT值亦逐漸縮短。傷后12h～3d，2組的電生理檢測(cè)指標(biāo)無明顯差別；傷后7d和14d，實(shí)驗(yàn)組電生理檢測(cè)指標(biāo)顯著優(yōu)于對(duì)照組（P<0.01）。見圖 2。

3 討論

脊髓損傷作為一種嚴(yán)重的創(chuàng)傷，可以激發(fā)機(jī)體引起損傷組織強(qiáng)烈的免疫炎性反應(yīng)。從嚴(yán)格意義上來講，脊髓損傷后免疫炎性反應(yīng)是一把雙刃劍。一方面該過程可以清除壞死組織，促進(jìn)組織細(xì)胞增生和創(chuàng)面修復(fù)。另一方面，嚴(yán)重的創(chuàng)傷時(shí)存在炎性反應(yīng)的過度激活，這將導(dǎo)致脊髓組織進(jìn)一步的損傷，妨礙脊髓組織的修復(fù)和神經(jīng)元的再生，導(dǎo)致神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等繼發(fā)性的壞死和凋亡，從而阻礙損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)［5］。

脊髓損傷后免疫炎性細(xì)胞的聚集受多種蛋白質(zhì)的調(diào)控，ICAM-1又名CD54，是淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原l的細(xì)胞表面配基。ICAM-1可促進(jìn)中性粒細(xì)胞對(duì)組織的浸潤(rùn)而增強(qiáng)免疫應(yīng)答，促進(jìn)中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，這些因素共同導(dǎo)致中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和活化。本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)檢測(cè)了脊髓損傷后脊髓組織ICAM-1mRNA的表達(dá)，結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)ICAM-1mRNA相對(duì)含量均低于對(duì)照組，提示該補(bǔ)體抑制劑對(duì)脊髓損傷組織中ICAM-1mRNA表達(dá)具有的顯著抑制作用，證明了其對(duì)免疫炎性反應(yīng)的抑制作用。

近幾年來，通過抑制補(bǔ)體激活機(jī)制抑制脊髓損傷后的免疫炎性反應(yīng)已經(jīng)成為脊髓損傷實(shí)驗(yàn)性治療的一個(gè)重要策略和熱點(diǎn)方向。Reynolds等［6］發(fā)現(xiàn)痘病毒補(bǔ)體調(diào)控蛋白能夠顯著抑制大鼠脊髓損傷后的補(bǔ)體表達(dá)，減輕脊髓損傷。Qiao等［7］的研究表明，補(bǔ)體經(jīng)典途徑與旁路途徑在脊髓損傷中起到重要作用，抑制補(bǔ)體激活可減輕損傷組織炎性反應(yīng)，保護(hù)脊髓功能。Tei等［8］研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)體C1酯酶抑制劑能夠顯著抑制補(bǔ)體系統(tǒng)激活，保護(hù)神經(jīng)功能。作者在前期的研究中亦發(fā)現(xiàn)，重組可溶性補(bǔ)體受體I型可顯著抑制大鼠脊髓損傷后的補(bǔ)體激活，抑制免疫炎性反應(yīng)，對(duì)神經(jīng)功能發(fā)揮顯著的保護(hù)作用［9］。

本研究采用MEP評(píng)價(jià)脊髓損傷損傷后的運(yùn)動(dòng)功能，使研究結(jié)果更加客觀可靠。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組在傷后7d和14d電生理檢測(cè)指標(biāo)顯著優(yōu)于對(duì)照組，提示該補(bǔ)體抑制成分通過抑制脊髓損傷后的免疫炎性反應(yīng)對(duì)神經(jīng)功能發(fā)揮顯著的保護(hù)作用。該研究為急性脊髓損傷的抗補(bǔ)體治療提供了理論依據(jù)。

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（編輯陳 姜，英文編輯劉寶林）

Effect of Inhibiting Component of Complement in Ephedra Sinica on Acute Spinal Cord Injury in Rats

LI Liang-man1，LI Jing-bo2，ZHU Yue1
（1.Department of Orthopedics；2.Department of Infectious Disease，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the effect of complement inhibiting component of Ephedra sinica on acute spinal cord injury in rats.MethodsThe inhibiting component of complement in Ephedra sinica was isolated and purified by multiple precipitative steps and thin layer chromatography，the activity was evaluated.Induction of spinal cord injury was performed following a modified Allen’s weight-drop method.CH50method was used for Measurement of complement hemolytic activity.ICAM-1mRNA level was evaluated by real time PCR technique.ResultsCH50and ICAM-1mRNA levels were significantly reduced in the Ephedra sinica group compared with the Control group at 12h，1，3，7，14d after spinal cord injury.On the 7th and 14th day，the levels of latency and amplitude in Ephedra sinica group were significantly better than those of Control group （P<0.01）.ConclusionThe inhibiting component of complement in Ephedra sinica significantly reduced immunological inflammation after spinal cord injury，and played an important protective function in secondary spinal cord injury.

Ephedra sinica；Spinal cord injury；Inflammation；Evoked potential

R338

A

0258-4646（2011）05-0405-03

http：//www.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20110523.1816.029.html

遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目（2010225034）

李良滿（1971-），男，副教授，博士.

朱悅，E-mail：yuezhudr@163.com

2011-01-17

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2011-05-1815：25