張曉紅，夏春波，劉源劼，蔣常文，門(mén) 楠

(桂林醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，廣西桂林541004)

X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)是IAP家族中最有效的Caspase抑制劑［1］，可直接抑制Ccaspase并可多途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡［2］，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有密切關(guān)系。但XIAP是大分子物質(zhì)，難以通過(guò)血腦屏障而限制了其臨床應(yīng)用［3］。研究顯示人類(lèi)免疫缺陷病毒—反式轉(zhuǎn)錄激活因子(TAT)蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)是TAT蛋白的堿性氨基酸區(qū)［4，5］，是轉(zhuǎn)導(dǎo)功能較強(qiáng)而確切的一種PTD。以TAT連接構(gòu)成融合蛋白，在體內(nèi)、外已成功使膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等生物大分子跨越血腦屏障至腦內(nèi)［6］。2010年4～9月，我們將大鼠 XIAP基因克隆至pTAT-HA質(zhì)粒載體，構(gòu)建了pTAT-XIAP融合蛋白表達(dá)載體，旨在為其用于臨床神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 質(zhì)粒及菌株:pTAT-HA質(zhì)粒(美國(guó)Steven F Dowdy惠贈(zèng))，BL21plysS感受態(tài)細(xì)胞(TI ANGEN公司)。主要試劑:UNIQ-10柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒(Sangon公司)，DNA Marker(MBI公司)，考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒(南京建成科技有限公司)，蛋白Marker(Fermentas公司)，IPTG、考馬斯亮藍(lán)R250染色液、尿素、咪唑(Amresco公司)，氨芐青霉素。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 XIAP基因合成 根據(jù)大鼠XIAP的cDNA序列由上海生工公司合成基因，兩端帶有Nco I和Xho I酶切位點(diǎn)。

1.2.2 pTAT-XIAP融合蛋白表達(dá)載體構(gòu)建 用Nco I和Xho I酶對(duì)pTAT-HA質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，將XIAP基因插入Nco I和Xho I酶切位點(diǎn)，構(gòu)建pTAT XIAP融合蛋白表達(dá)載體。取50 μl BL21plysS感受態(tài)細(xì)胞于冰水浴，加入5 μl pTAT-XIAP質(zhì)粒DNA，冰浴靜置30 min，將離心管置于42℃水浴90 s，冰浴冷卻3 min，向離心管中加入450 μl LB液體培養(yǎng)基(不含抗生素)，37℃搖床震蕩培養(yǎng)45 min。取轉(zhuǎn)化菌液加到LB固體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素)，37℃培養(yǎng)12～16 h。以未轉(zhuǎn)化菌和轉(zhuǎn)化pTAT-HA空載體的菌株作為對(duì)照。

1.2.3 pTAT-XIAP質(zhì)粒擴(kuò)增及鑒定 挑取pTATXIAP質(zhì)粒陽(yáng)性菌落接種至LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，以UNIQ-10柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，獲取質(zhì)粒DNA，1%瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。質(zhì)粒于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 pTAT-XIAP融合蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析 將陽(yáng)性克隆菌落接種于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性菌落置于3 ml含氨芐青霉素100 mg/L的LB培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜，取活化的大腸桿菌(pTAT-XIAPBL21plysS)菌液接種于 10 ml LB (Amp 100 mg/L)培養(yǎng)液中，當(dāng)OD600達(dá)0.8～1時(shí)，IPTG 30℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h。離心收集誘導(dǎo)菌，PBS洗滌2次，用菌裂解液［含0.5 mol/L的NaCl、0.02 mol/L的Tris-HCI(pH7.9)、0.01 mol/L的咪唑］重懸菌體，4℃靜置30 min，冰浴下超聲破菌，4℃、12 000 r/min離心10 min，留取總蛋白、上清進(jìn)行電泳分析，沉淀部分分別用2 M和4 M尿素洗滌，8 M尿素溶解包涵體于4℃過(guò)夜。將總蛋白、上清和包涵體蛋白及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌，加入1×SDS凝膠加樣緩沖液100℃煮沸10 min，沉淀4℃離心1 min取上清加樣，用12%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將凝膠浸泡于考馬斯亮藍(lán)R250染色2 h，脫色液脫色至背景清晰為止。照相，確定融合蛋白的表達(dá)情況。

1.2.5 重組pTAT-XIAP融合蛋白鑒定 各取20 μl蛋白樣品100℃加熱10 min，行12%SDS-PAGE，電泳結(jié)束后電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上進(jìn)行Western blot分析:5%脫脂奶粉封閉1 h，加入小鼠抗6×His單克隆抗體作用3 h，TBS洗滌3×10 min，再用HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體孵育1 h，洗膜后用ECL發(fā)光試劑顯色，X線曝光顯影。

2 結(jié)果

2.1 載體瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 pTAT-XIAP質(zhì)粒約4 500 bp，pTAT-HA質(zhì)粒約3 000 bp，條帶大小與質(zhì)粒圖譜一致。pTAT-XIAP經(jīng) NcoI/XhoI酶切鑒定，在Marker 3 000 bp可見(jiàn)載體pTAT-HA的條帶，在Marker1 500 bp可見(jiàn)XIAP的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。

2.2 融合蛋白表達(dá)形式鑒定 SDS-PAGE顯示pTAT-XIAP在約64 kD有一明顯的蛋白條帶出現(xiàn)，與理論值相符。pTAT-XIAP主要以包涵體的形式存在，進(jìn)一步優(yōu)化誘導(dǎo)條件，經(jīng)調(diào)整誘導(dǎo)溫度及IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間等，pTAT-XIAP仍主要以包涵體的形式存在。見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度IPTG 37℃誘導(dǎo)4 h的SOS-PAGE分析

2.3 重組pTAT-XIAP融合蛋白鑒定 取誘導(dǎo)后上清和沉淀、未誘導(dǎo)菌體及空載體蛋白進(jìn)行 SDSPAGE，然后電轉(zhuǎn)移到NC膜上，用小鼠抗6×His單克隆抗體作為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG作為二抗，顯影后于約64 kD處可見(jiàn)一清晰條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。

3 討論

影響E.coil蛋白表達(dá)量的因素除載體啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)外，表達(dá)菌對(duì)密碼子的偏好性、表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主菌毒性作用而引起質(zhì)粒的不穩(wěn)定等均是導(dǎo)致原核表達(dá)失敗的原因［7，8］。本研究質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)化菌的選擇時(shí)已排除以上因素的影響，目的融合蛋白主要以包涵體的形式存在。

人類(lèi)Ⅰ型免疫缺陷病毒(HIV-1)的轉(zhuǎn)錄反式激活因子(Tat)能夠主動(dòng)穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。研究表明，TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域能夠?qū)⑴c之共價(jià)連接的生物大分子(如核酸、多肽、蛋白質(zhì)等)非特異地轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)部，這種過(guò)程既不依賴于受體和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，也與溫度和能量無(wú)關(guān)［9］，且對(duì)宿主細(xì)胞幾乎沒(méi)有毒性，顯示出巨大的應(yīng)用價(jià)值。TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域具有以下優(yōu)點(diǎn):①操作簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高。②轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)在細(xì)胞中均具有生物活性，并能夠穿過(guò)血腦屏障，因此對(duì)心腦血管疾病的治療具有重要意義［10］。③作用迅速，可進(jìn)入所有細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞的損害相對(duì)較小。TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域目前已成功將相對(duì)分子質(zhì)量在15～120 kD的不同蛋白導(dǎo)入細(xì)胞，且均具有生物活性，并能夠穿過(guò)血腦屏障［11］。另有研究顯示XIAP具有強(qiáng)大的抗凋亡作用，有望用于治療神經(jīng)退行性疾病、腦缺血等神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

本研究構(gòu)建了pTAT-XIAP原核表達(dá)載體并成功表達(dá)出目的融合蛋白，為研究該蛋白的體內(nèi)生物活性奠定了基礎(chǔ);pTAT-XIAP原核表達(dá)載體有望為治療神經(jīng)退行性疾病開(kāi)辟新途徑。

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