岳盈盈，李志會，李 鵬，宋楠楠，趙元昊，孟 紅

(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，山東省罕少見病重點實驗室，濟(jì)南250062)

手足口病(HFMD)是全球性傳染病。引起HFMD的腸道病毒有20多種(型)，以腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A16最為常見;其中EV71引起的HFMD最為嚴(yán)重，可引起心肌炎、肺水腫、腦膜腦炎、脊髓灰質(zhì)炎樣癱瘓等并發(fā)癥［1］，病死率高。目前臨床對EV71感染以對癥治療為主，尚無有效的抗病毒藥物。研制安全有效的疫苗和早期診斷試劑盒是防控EV71感染的當(dāng)務(wù)之急。2010年2月，我們采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對EV71 VP1蛋白的第2-274aa進(jìn)行表達(dá)及鑒定，并對其表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為EV71疫苗的研究和檢測試劑盒的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 RD細(xì)胞由山東省疾控中心贈送;EV71病毒株、E.coli TOP10、PET30a(+)為本室保存; Transetta(DE3)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;pMD18-T載體、限制性內(nèi)切酶及蛋白酶購自大連寶生物工程公司;1640培養(yǎng)基購自GIBCO公司; D2000 DNA marker、Taq酶、RNA提取試劑盒、質(zhì)粒純化試劑盒及DNA凝膠電泳回收試劑盒購自北京泰天河生物技術(shù)有限公司;其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 目的基因選擇及引物設(shè)計 查閱Genbank中VP1基因序列設(shè)計引物，在上游引物5'端引入NdeⅠ酶切位點(CATATG)，下游引物5'端引入XhoⅠ酶切位點(CTCGAG)，序列如下:EVPLS(上游):5＇-GGAATTCCATATGGATAGGGTGGCAGATGTAAT-3＇; EVPLA(下游):5＇-CCGCTCGAGGTTGGCTTTGAAT-AGGTAGTT-3＇。引物由北京博尚生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 EV71總RNA提取及目的基因擴增 常規(guī)培養(yǎng)RD細(xì)胞，待細(xì)胞生長成單層后以感染復(fù)數(shù)量(M.O.I)＞5的 EV71接種細(xì)胞，待細(xì)胞病變達(dá)90%時收獲。棄培養(yǎng)上清，RNA提取試劑盒提取RNA并以其為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，體系為20 μl，混勻后置37℃、60 min。PCR反應(yīng)體系為25 μl，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min，94℃、30 s，45℃、30 s，72℃、30 s，32個循環(huán);72℃延伸10 min。取擴增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，DNA凝膠電泳回收試劑盒回收目的帶。

1.4 表達(dá)載體pET30a(+)-VP1構(gòu)建 將上述回收片段連接于pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)菌株，提取質(zhì)粒做NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定并委托北京博尚生物技術(shù)有限公司測序。將片段與經(jīng)相同雙酶切的 pET30a(+)質(zhì)粒連接、轉(zhuǎn)化 Transetta (DE3)感受態(tài)菌株。用PCR方法進(jìn)行鑒定。

1.5 目的蛋白鑒定 挑取PCR鑒定陽性菌落接種于5 ml LB培養(yǎng)液中，37℃劇烈震蕩培養(yǎng)16 h，以1∶100轉(zhuǎn)接于新鮮LB培養(yǎng)液中，37℃劇烈震蕩培養(yǎng)至A600約為0.8，加入終濃度為1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)繼續(xù)37℃劇烈震蕩培養(yǎng)4 h，取1 ml菌液，4 000 rpm離心10 min收集菌體，加入去離子水和2×SDS蛋白凝膠加樣緩沖液各100 μl重懸，煮沸10 min，12 000 rpm離心10 min。取上清液20 μl與蛋白Marker同時行SDSPAGE電泳，用考馬斯亮藍(lán)R250染色，脫色液脫色后觀察有無目的條帶。

1.6 重組蛋白表達(dá)鑒定 采用Western Blot法。十二烷基硫酸鈉—聚丙稀酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，5%脫脂奶粉封閉，先后加臨床陽性血清、羊抗人IgM-HRP，反應(yīng)條件均為37℃、2 h。洗膜后以DAB顯色，出現(xiàn)棕色條帶者判為陽性。

1.7 重組蛋白表達(dá)條件優(yōu)化 分別在20、30和37℃下，采用濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/ L的IPTG，對目的蛋白進(jìn)行1、2、4、6 h的誘導(dǎo)表達(dá)。取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用Bandscan軟件分析表達(dá)蛋白占總蛋白的百分比，根據(jù)結(jié)果確定重組蛋白的最佳表達(dá)條件。

2 結(jié)果

2.1 目的基因擴增 RT-PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，在857 bp處獲得特異性條帶，與預(yù)期目的基因VP1蛋白的同源率均在99%以上，與2008年的安徽阜陽分離株相同區(qū)段的VP1蛋白氨基酸序因大小一致(圖1)。測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對，與大部分EV71列(GenBank: ACD63039)的同源率為100%。

2.2 表達(dá)載體pET30a(+)-VP1的構(gòu)建與鑒定

重組質(zhì)粒pET30a(+)-VP1經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切后，進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在831 bp、5 422 bp獲得電泳帶，大小與VP1及載體片段長度一致(圖2)。

2.3 目的蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳 SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果顯示，含重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)菌在相對分子質(zhì)量約為30 kD處出現(xiàn)一強蛋白條帶，而空載體菌在相應(yīng)位置未出現(xiàn)該蛋白條帶(圖3)。

2.4 重組蛋白Western Bolt鑒定 以陽性血清為一抗，羊抗人IgM為二抗進(jìn)行Western blot，結(jié)果顯示表達(dá)的融合蛋白在30kD處出現(xiàn)陽性條帶，而空載體菌對照與陽性血清無反應(yīng)(圖4)。

2.5 重組蛋白表達(dá)優(yōu)化條件 在37℃，采用濃度為1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4 h效果最好。

3 討論

20世紀(jì)90年代開始，EV71在亞太地區(qū)的流行有上升趨勢。進(jìn)入2009年以后，除西藏外，我國30個省份均有病例發(fā)生，主要集中于河南、山東、江蘇、廣西、安徽等省，危重病例較往年增加。VP1、VP2和VP3三個多肽暴露在病毒外殼的表面，而VP4包埋在病毒外殼的內(nèi)側(cè)與病毒核心緊密連接。其中VP1被認(rèn)為有著最多的抗原決定簇［2］，是主要的病毒中和決定因子，直接決定病毒的抗原性，在疫苗研發(fā)和診斷試劑盒開發(fā)方面有廣泛的應(yīng)用前景。

目前已經(jīng)有相當(dāng)多的研究證實了VP1蛋白作為抗原用于診斷和疫苗預(yù)防的有效性。Foo等［3］僅利用VP1蛋白上的一段多肽序列就在小鼠模型中觀察到了良好的免疫保護(hù)反應(yīng)。Chen等［4］構(gòu)建了能夠表達(dá)VP1的轉(zhuǎn)基因番茄，小鼠口服后血清中檢測到了EV71的特異性抗體。Chen HL和他的研究小組［5］則通過制備轉(zhuǎn)基因小鼠的方式使重組VP1蛋白出現(xiàn)在母鼠的乳汁中，動物進(jìn)食這種乳汁可產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)反應(yīng)。Chiu等［6］采用減毒的鼠疫沙門氏菌展示表達(dá)了VP1蛋白并將其作為疫苗，其免疫保護(hù)作用在小鼠模型的實驗中得到了證實。本研究選擇EV71結(jié)構(gòu)蛋白VP1第2-274aa在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行克隆表達(dá)并對其抗原性進(jìn)行初步鑒定，進(jìn)而確定蛋白表達(dá)的最佳條件為30℃、0.6 mmol/L IPTG，誘導(dǎo)表達(dá)4 h。

本研究成功表達(dá)并鑒定了EV71 VP1抗原;為EV71疫苗研制及檢測試劑盒的建立奠定了基礎(chǔ)。

［1］Ishimaru Y，Nakano S，Yamaoka K，et al.Outbreaks of hand，foot，and mouth disease by enterovirus 71.High incidence of complication disorders of central nervous system［J］.Arch Dis Child，1980，55 (8):583-588.

［2］Shih SR，Li YS，Chiou CC，et al.Expression of capsid［correction of caspid］protein VP1 for use as antigen for the diagnosis of enterovirus 71 infection［J］.J Med Virol，2000，61(2):228-234.

［3］Foo DG，Alonso S，Chow VT，et al.Passive protection against lethal enterovirus 71 infection in newborn mice by neutralizing antibodies elicited by a synthetic peptide［J］.Microbes Infect，2007，9 (11):1299-1306.

［4］Chen HF，Chang MH，Chiang BL，et al.Oral immunization of mice using transgenic tomato fruit expressing VP1 protein from enterovirus 71［J］.Vaccine，2006，24(15):2944-2951.

［5］Chen HL，Huang JY，Chu TW，et al.Expression of VP1 protein in the milk of transgenic mice:a potential oral vaccine protects against enterovirus 71 infection［J］.Vaccine，2008，26(23):2882-2889.

［6］Chiu CH，Chu C，He CC，et al.Protection of neonatal mice from lethal enterovirus 71 infection by maternal immunization with attenuated Salmonella enterica serovar Typhimurium expressing VP1 of enterovirus 71［J］.Microbes Infect，2006，8(7):1671-1678.