黃大林，袁桂峰，王 鑫，李彬彬，鐘 江*

(1桂林醫(yī)學(xué)院，廣西桂林541004;2復(fù)旦大學(xué))

桿狀病毒是一類雙鏈DNA大型病毒，能夠感染600多種昆蟲，可在感染的昆蟲細(xì)胞中形成特征性的病毒包涵體。苜蓿銀紋夜蛾多角體病毒(AcMNPV)是昆蟲桿狀病毒科核多角體病毒屬的模式種，也是研究最多的桿狀病毒。桿狀病毒由于其自身的獨(dú)特性使它成為一種新型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因表達(dá)和基因治療的載體［1］。上世紀(jì)80年代建立的桿狀病毒—昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)成為一種最常用的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。但是感染病毒作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移載體也有一些缺點(diǎn):在體內(nèi)會(huì)引起補(bǔ)體反應(yīng);帶入的表達(dá)框在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可能被沉默;對(duì)不同細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移效率有很大差別。2009年11月～2010年6月，我們使用Bac-to-Bac系統(tǒng)成功構(gòu)建鼠IL-2基因桿狀病毒表達(dá)載體?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 采用SPF級(jí)40日齡的昆明小鼠進(jìn)行試驗(yàn)，體質(zhì)量(22.08±3.00)g。采用拉頸法處死小鼠，無(wú)菌打開腹腔取出小鼠脾臟，使用100目細(xì)胞篩網(wǎng)制備脾細(xì)胞懸液，采用淋巴細(xì)胞分離液分離出淋巴細(xì)胞。

1.2 菌種和質(zhì)粒 大腸桿菌JF1125;昆蟲細(xì)胞草地夜蛾卵巢組織細(xì)胞系Sf9;苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)、質(zhì)粒pFastBacDual及T-CMVp等由復(fù)旦大學(xué)微生物學(xué)與微生物工程系鐘江課題組實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 試劑 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶和堿性

磷酸酶購(gòu)自TaKaRa大連寶生物工程公司;TNM-FH培養(yǎng)液由購(gòu)自Sigma公司的粉劑配制，加10%的小牛血清使用。轉(zhuǎn)染試劑CellFectin購(gòu)自Invitrogen公司;DNA凝膠回收試劑盒以及PCR產(chǎn)物回收試劑盒購(gòu)自上海杰瑞生物科技有限公司;細(xì)胞總RNA抽提試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量:λDNA/EcoRⅠ+ HindⅢ購(gòu)自 MBI Fermentas公司;DL2000購(gòu)自物TaKaRa公司;RNase A購(gòu)自上海華舜生物工程有限公司;Taq DNA polymerase購(gòu)自北京天根公司，蛋白酶K購(gòu)自Roche公司。

1.4 方法

1.4.1 小鼠IL-2基因的獲得及鑒定 將鼠脾淋巴細(xì)胞在刀豆球蛋白A(Con A)的刺激下體外培養(yǎng)27 h后，提取激活淋巴細(xì)胞總RNA;參照GenBank發(fā)表的鼠IL-2 cDNA基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物IL-2 F:5'-ATATCTAGAATACAGCAGCATGCAGCTCGC-3'，R:5'-TCTGCTACCTTAGTCGTCGTGGTCTTTGTAGTCTTGAGGGCTTGTTGAGATG-3'，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定。

1.4.2 重組含有小鼠IL-2基因質(zhì)粒載體 用XbaⅠ/KpnⅠ雙酶分別切pFastBac質(zhì)粒和IL-2的PCR產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳割膠回收DNA，分別作為載體和供體片段，通過(guò)T4連接酶連接得到pFBIL2，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化大腸桿菌JF1125得到pFB-IL2質(zhì)粒，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和PCR鑒定。

1.4.3 載體加入真核細(xì)胞啟動(dòng)子CMV 用EcoRⅠ酶切pFB-IL2(需CIAP去磷酸化處理)和T-CMVp上切下CMV啟動(dòng)子片段，分別作為載體和供體片段，通過(guò)T4連接酶在16℃連接12 h，CMV啟動(dòng)子插入pFB-IL2的EcoRⅠ位點(diǎn)，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化大腸桿菌JF1125得到pFB-CMV-IL2質(zhì)粒，提取質(zhì)粒DNA。

1.4.4 重組小鼠IL-2基因質(zhì)粒載體的酶切鑒定和序列分析驗(yàn)證 pFB-CMV-IL2質(zhì)粒用KpnⅠ、XbaⅠ和BgⅡ分別進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果正確后并將構(gòu)建的pFB-CMV-IL2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化JF1125，將菌液進(jìn)行質(zhì)粒序列分析測(cè)定。

1.4.5 重組Bacmid-pFB-CMV-IL2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞 利用Invitrogen公司的產(chǎn)品Bac-to-Bac系統(tǒng)來(lái)構(gòu)建重組桿狀病毒，挑取轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞生長(zhǎng)的白色菌落，提取Bacmid，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將

Bacmid-pFB-CMV-IL2轉(zhuǎn)染 Sf9細(xì)胞包裝病毒，Sf9細(xì)胞培養(yǎng)于Sf 900Ⅱ培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 d，收獲上清獲取完整重組桿狀病毒，反復(fù)感染Sf9細(xì)胞擴(kuò)增病毒。提取病毒基因組，抽病毒基因組的步驟為:①500 μl病毒液中加入500 μl 20%的PEG8000和1.6 mmol/ L NaCl的混合液，室溫放置30 min，12 000 r/min離心15 min。②棄上清，沉淀加入20 μl水，80 μl裂解液和5 μl蛋白酶并混勻，50℃保溫1 h。③用苯酚—氯仿—異戊醇抽提直至上下兩相分明，兩相間無(wú)明顯雜質(zhì)。④加入兩倍體積的無(wú)水乙醇，－20℃放置10 min，離心10 min，棄上清后烘干沉淀，加入16 μl無(wú)菌水－20℃保存?zhèn)溆谩Ｓ肞CR驗(yàn)證重組桿狀病毒的正確性。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為500 bp，與陽(yáng)性對(duì)照IL-2吻合，表明已經(jīng)成功擴(kuò)出IL-2目的片段。

2.2 PCR技術(shù)鑒定pFB-IL-2質(zhì)粒結(jié)果 表明目的片段IL-2已經(jīng)成功重組入載體中，見圖1。

圖1 PCR檢測(cè)PFB-IL-2質(zhì)粒

2.3 酶切pFB-CMV-IL2質(zhì)粒結(jié)果 用KpnⅠ酶切PFB-CMV-IL-2分別得到0.5 kb、0.7 kb和4.7 kb 3個(gè)片段;用XbaⅠ酶切得到0.7 kb和5.2 kb 2個(gè)片段;用BglⅡ酶切得到0.5 kb、1.8 kb和3.6 kb 3個(gè)片段，與預(yù)期結(jié)果吻合，表明成功重組構(gòu)建PFBCMV-IL-2載體。

2.4 菌液測(cè)序結(jié)果 利用Blast軟件在GenBank進(jìn)行序列比對(duì)，菌液測(cè)序結(jié)果與GenBank鼠IL-2相吻合，成功構(gòu)建含鼠IL-2的載體質(zhì)粒，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果正確。

2.5 重組桿狀病毒穿梭載體的PCR驗(yàn)證 提取病毒DNA基因組，用IL-2特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，成功擴(kuò)出了一條約500 bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，證明重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-IL-2重組成功。見圖2。

圖2 PCR鑒定重組桿狀病毒基因組

3 討論

桿狀病毒載體重組桿狀病毒構(gòu)建方便，易于擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模及獲得高滴度的病毒，桿狀病毒的基因組和棒狀的核衣殼可以容納100 kb的DNA，最大可插入約40 kb的外源基因;能轉(zhuǎn)染末端分化細(xì)胞和原代培養(yǎng)細(xì)胞;當(dāng)以高感染復(fù)數(shù)感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，沒(méi)有細(xì)胞毒性，安全性好，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)不會(huì)整合到基因組中，不能自行復(fù)制，自身啟動(dòng)子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)也沒(méi)有活性［2］。Bac-to-Bac系統(tǒng)將桿狀病毒—昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)變?yōu)榱艘粋€(gè)具有廣泛應(yīng)用前景的系統(tǒng)，這個(gè)系統(tǒng)將外源基因通過(guò)定向重組克隆到桿狀病毒基因組上多角體啟動(dòng)子后，成功構(gòu)建桿狀病毒的穿梭質(zhì)粒，整個(gè)重組過(guò)程都在大腸桿菌中完成，重組子可以通過(guò)抗生素和lacZ標(biāo)記方便挑選。只要將大腸桿菌中的穿梭質(zhì)粒即病毒基因組提取出來(lái)，轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞就可以得到重組病毒。隨著桿狀病毒—昆蟲表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用范圍越來(lái)越廣，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展出一系列用于定向轉(zhuǎn)座的供體質(zhì)粒，甚至能利用桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)多個(gè)蛋白。由于有高效表達(dá)啟動(dòng)子(多角體啟動(dòng)子和p10啟動(dòng)子)，表達(dá)外源蛋白效率高［3］;可對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行糖基化修飾;容易擴(kuò)大規(guī)模達(dá)到生產(chǎn)要求。迄今已經(jīng)通過(guò)桿狀病毒—昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了許多外源基因，例如雞胃酶解肌球蛋白、視紫質(zhì)激酶、人類β-干擾素等。

IL-2主要是由激活T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一類Th1型細(xì)胞因子，在抗腫瘤、抗毒素、免疫調(diào)節(jié)及治療感染性疾病中具有重要作用，具有十分重要的免疫生理調(diào)節(jié)效應(yīng)［4，5］。自 Taniguchi等［6］從人體細(xì)胞中首次克隆出IL-2全長(zhǎng)cDNA并報(bào)道其全序列以來(lái)，已從30多種動(dòng)物中克隆出此基因，重組IL-2也在提高機(jī)體免疫力、抗感染和治療癌癥等方面獲得了廣泛的應(yīng)用［7］。

本試驗(yàn)首先通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增出IL-2基因，通過(guò)構(gòu)建鼠 IL-2的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，通過(guò)克隆將其插入pFastBacDual，成功構(gòu)建了桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移載體pFB-CMV-IL2質(zhì)粒，通過(guò)轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，成功獲得含IL-2的重組桿狀病毒，為進(jìn)一步研究該蛋白的最佳表達(dá)、生物學(xué)活性、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等奠定了良好的基礎(chǔ)，同時(shí)亦為其他蛋白質(zhì)的真核表達(dá)提供了方法學(xué)的參考。

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