于林芳,徐 杰,陳士國,薛 勇,王靜鳳,李兆杰,薛長湖

(中國海洋大學(xué),食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003)

仿刺參皂苷類化合物的電噴霧負(fù)離子質(zhì)譜裂解規(guī)律研究

于林芳,徐 杰,陳士國,薛 勇,王靜鳳,李兆杰,薛長湖

(中國海洋大學(xué),食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003)

采用電噴霧-四極桿-飛行時間質(zhì)譜(ESI-Q-TOF MS)在負(fù)離子檢測方式下,對仿刺參中4種皂苷類成分的裂解途徑進行研究。通過 ESI-MS產(chǎn)生的[M-H]-獲得相應(yīng)化合物的相對分子質(zhì)量信息,對[MH]-進行碰撞誘導(dǎo)解離(CID)獲得相應(yīng)化合物的裂解途徑信息。研究發(fā)現(xiàn),4種皂苷化合物的 ESI-MS/MS裂解規(guī)律相同,首先斷裂苷元上的18(20)內(nèi)酯鍵,然后連續(xù)丟失糖鏈的末端單糖,最后生成苷元的特征碎片離子m/z423,這些特征有助于皂苷類化合物的結(jié)構(gòu)解析。

仿刺參;皂苷;質(zhì)譜;裂解規(guī)律

海參皂苷是棘皮動物海參體內(nèi)所特有的一類三萜皂苷,由苷元和寡糖鏈兩部分組成,苷元均為羊毛甾烷的衍生物,寡糖鏈一般由2～6個單糖組成,常見的單糖有木糖(Xyl)、奎諾糖(Qui)、葡萄糖(Glc)、甲基葡萄糖(MeGlc)和甲基木糖(MeXyl),其化學(xué)結(jié)構(gòu)較復(fù)雜,且呈現(xiàn)多樣性[1]。研究表明,海參皂苷具有抗真菌、抗病毒、細胞毒活性、免疫調(diào)節(jié)等廣泛的藥理活性[2-6]。仿刺參(A postichopus japonicusSelenka)在食用海參中品質(zhì)最好,具有較高的食用和藥用價值[7],因此,對仿刺參體內(nèi)皂苷的結(jié)構(gòu)研究具有重要意義。

由于皂苷類化合物具有極性大、難揮發(fā)、相對分子質(zhì)量大等特點,因此分離純化及結(jié)構(gòu)測定具有一定的難度。目前,已有文獻[8-10]報道采用質(zhì)譜技術(shù)對皂苷類結(jié)構(gòu)的研究,但對海參皂苷的質(zhì)譜研究鮮有報道。本工作探討仿刺參體內(nèi)皂苷類成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律,應(yīng)用電噴霧負(fù)離子模式對分離得到的皂苷單體進行二級質(zhì)譜研究,分析討論4種皂苷的主要特征碎片離子,發(fā)現(xiàn)并總結(jié)裂解規(guī)律,為進一步研究其他具有相似結(jié)構(gòu)的皂苷類化合物提供依據(jù)。

1 試驗部分

1.1 主要儀器與裝置

Ultima GLOBAL Q-TOF質(zhì)譜儀:美國Waters公司產(chǎn)品,配有電噴霧離子源(ESI)及Masslynx 4.1工作站。

1.2 主要材料與試劑

海參皂苷 (holotoxinA1、holotoxinB1、holotoxin A和cladoloside B):由本實驗室從仿刺參中提取制備并純化,其化學(xué)結(jié)構(gòu)式示于圖1;乙腈(色譜純):美國 Muskegon公司產(chǎn)品;超純水:美國Millipore公司產(chǎn)品。

1.3 試驗條件

電噴霧離子化,負(fù)離子模式檢測,毛細管電壓3.0 kV,錐孔電壓35 V,碰撞誘導(dǎo)解離(CID)能量50 eV,離子源溫度80℃,干燥氣溫度150℃,質(zhì)量掃描范圍m/z200～2 000,霧化氣(N2)流速15 L/h,干燥氣(N2)流速250 L/h,碰撞氣為氬氣,直接進樣法進樣。

圖1 4種皂苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of four triterpene glycosides

2 結(jié)果與討論

2.1 一級質(zhì)譜分析

4種皂苷結(jié)構(gòu)相似,僅糖鏈上的單糖組成及數(shù)量有差別,在電噴霧質(zhì)譜中均以[M-H]-準(zhǔn)分子離子形式存在,幾乎沒有碎片離子,易于確定化合物的相對分子質(zhì)量。4種皂苷的一級質(zhì)譜圖示于圖2。

2.2 二級質(zhì)譜裂解規(guī)律分析

為了研究分子結(jié)構(gòu)與裂解途徑之間的關(guān)系,分別對4種皂苷類化合物的[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰進行CID分析。由于4種化合物具有基本骨架相同、結(jié)構(gòu)相似的特點,通過比較結(jié)構(gòu)信息和質(zhì)譜信息,發(fā)現(xiàn)它們在軟電離狀態(tài)下均存在中性丟失和一系列糖苷鍵斷裂的裂解碎片。

圖2 4種皂苷的負(fù)離子ESI-MS圖Fig.2 ESI-MS spectra of four triterpene glycosides in negative mode

2.2.1 Holotoxin A1的二級質(zhì)譜分析 Holotoxin A1的準(zhǔn)分子離子[M-H]-為m/z1 391,通過適當(dāng)調(diào)整碰撞解離電壓,在一定氣體碰撞能量下進一步碎裂,生成一系列糖苷鍵斷裂產(chǎn)生的碎片離子,holotoxin A1的二級質(zhì)譜及裂解模式示于圖3。在MS/MS譜圖中,m/z1 347離子為[M-H]-失去44 u產(chǎn)生的碎片,推測可能為苷元上18(20)內(nèi)酯鍵斷裂后,丟失中性CO2片段生成的。該離子首先碎裂失去β糖鏈末端的MeGlc(176)和 Xyl(132),生成碎片離子m/z1 171(Y3β)和m/z1 039(Y2β);進一步丟失α糖鏈末端的MeGlc(176)和 Glc(162),生成碎片離子m/z863(D2β-1α)和m/z701(D2β-2α);繼續(xù)丟失 Qui(146)和 Xyl(132)后,生成m/z555(D1β-2α)離子和苷元的特征碎片離子m/z423(Y0),這也證實了中性CO2的丟失發(fā)生在苷元上。圖3a中未歸屬的碎片峰由其他次要的糖鏈斷裂模式生成,由于主要斷裂方式的碎片峰豐度較高,其他碎片峰并不影響判斷,因此沒有進一步歸屬。

2.2.2 Holotoxin B1的二級質(zhì)譜分析 Holotoxin B1與holotoxin A1結(jié)構(gòu)上的區(qū)別僅在于α糖鏈末端的單糖,選定holotoxin B1的準(zhǔn)分子離子峰m/z1 378進行碰撞,其主要二級裂解途徑與holotoxin A1相同,示于圖4。首先斷裂苷元上的18(20)內(nèi)酯鍵,生成豐度較高的m/z1 333離子,該離子先丟失β糖鏈末端的MeGlc(176)和 Xyl(132),生 成m/z1 157(Y3β) 和m/z1 025(Y2β)離子;再連續(xù)丟失α糖鏈末端的2個Glc(162),生成與holotoxin A1相同的m/z863(D2β-1α)和m/z701(D2β-2α)離子 ;最終丟失 Qui(146)和 Xyl(132)后,生成m/z423(Y0)的特征苷元碎片。圖4中也有其他次要的糖鏈裂解途徑生成的碎片峰,可見,雖然糖苷鍵斷裂方式多樣,但β糖鏈末端的MeGlc更易于斷裂丟失,因此該裂解方式生成的碎片峰豐度均較高。

2.2.3 Holotoxin A的二級質(zhì)譜分析 在一定的氣體碰撞能量下,對holotoxin A的準(zhǔn)分子離子m/z1 421進行CID碎裂,其二級質(zhì)譜圖示于圖5。m/z1 421離子也首先斷裂苷元上的18(20)內(nèi)酯鍵,生成m/z1 377離子,由于α和β糖鏈末端均為MeGlc(176)和 Glc(162),斷裂生成的碎片離子相同,根據(jù)2.2.1和2.2.2的結(jié)果,推測m/z1 377離子首先丟失β糖鏈末端的MeGlc(176)和 Glc(162),生成m/z1 201(Y3β)和m/z1 039(Y2β)離子 ;再丟失α糖鏈末端的 MeGlc(176)和 Glc(162),生成m/z863(D2β-1α)和m/z701(D2β-2α)離子 ;最后丟失 Qui(146)和 Xyl(132),生成m/z423(Y0)的特征苷元碎片。由于α和β糖鏈末端的2個單糖相同,斷裂生成的碎片離子相同,因此該MS/MS譜圖比較簡單,其他碎片峰較少。

圖3 Holotoxin A1的二級質(zhì)譜圖(a)及裂解模式圖(b)Fig.3 ESI-MS/MS spectra of holotoxin A1(a)and fragmentation pattern(b)

圖4 Holotoxin B1的二級質(zhì)譜圖Fig.4 ESI-MS/MS spectra of holotoxin B1

圖5 Holotoxin A的二級質(zhì)譜圖Fig.5 ESI-MS/MS spectra of holotoxin A

2.2.4 Cladoloside B的二級質(zhì)譜分析 Cladoloside B的糖鏈由5個單糖組成,選定cladoloside B的準(zhǔn)分子離子峰m/z1 215進行碰撞,其二級質(zhì)譜示于圖 6。該離子斷裂苷元上的18(20)內(nèi)酯鍵丟失中性CO2片段,生成豐度較高的m/z1 171離子;然后失去β糖鏈末端的MeGlc(176)和 Xyl(132),生成m/z995(Y3β)和m/z863(Y2β)離子;再丟失α糖鏈末端的 Glc(162),生成m/z701(D2β-1α)離子 ;最后丟失 Qui(146)和 Xyl(132),生成m/z423(Y0)的特征苷元碎片,裂解模式與前3種皂苷相同。

圖6 Cladoloside B的二級質(zhì)譜圖Fig.6 ESI-MS/MS spectra of cladoloside B

3 結(jié)論

采用電噴霧飛行時間質(zhì)譜法對仿刺參中4種皂苷類化合物的質(zhì)譜裂解途徑進行研究,分析了主要的特征碎片離子、裂解模式及相應(yīng)的ESI-MS/MS圖譜特征。4種皂苷類化合物的裂解途徑相似,均首先丟失中性分子CO2,然后丟失β糖鏈末端的2個單糖,再丟失α糖鏈末端的單糖,最后依次丟失 Qui和 Xyl,生成m/z423的苷元片段。這些碎片特征將為具有相似結(jié)構(gòu)特征的皂苷類化合物苷元及糖鏈的結(jié)構(gòu)解析提供重要依據(jù)。

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Study on the Fragmentation Pathways of Triterpene Glycosides from Apostichopus japonicus Selenka by Negative Electrospray Ionization Mass Spectrometry

YU Lin-fang,XU Jie,CHEN Shi-guo,XUE Yong,WANGJing-feng,LI Zhao-jie,XUE Chang-hu
(College ofFood Science and Technology,Ocean University of China,Qingdao266003,China)

The fragmentation pathways of four triterpene glycosides fromA postichopus japonicusSelenka were investigated in negative ion mode by ESI-Q-TOF MS.The[M-H]-ions were observed by ESI-MS,from which the molecular weights were obtained.The collision induced dissociation(CID)data of the[M-H]-ions provide fragmentation pathways of the triterpene glycosides.Results show that four compounds have the same fragmentation pathway.The cleavage is initiated by a loss of 18(20)-lactone residue from the aglycon,then consecutively loses monosaccharide residue of sugar chain,and finally yields a signature ion peak atm/z423.These characteristic fragmentations will be helpful in identifying the structures of triterpene glycosides.

A postichopus japonicusSelenka;triterpene glycosides;mass spectrometry;fragmentation pathways

薛長湖(1964～),男(漢族),江蘇興化人,從事水產(chǎn)品加工、水產(chǎn)化學(xué)研究。E-mail:xuech@ouc.edu.cn

O 657.63

A

1004-2997(2011)02-0077-05

2010-05-07;

2010-07-22

國家自然科學(xué)基金(31000795),海洋公益性行業(yè)科研專項(201105029),國際科技合作項目(2010DFA31330)資助

于林芳(1985～),女(漢族),山東煙臺人,碩士研究生,從事天然產(chǎn)物提取純化研究。E-mail:yulinfang77@yahoo.cn