申玉星,全 燦,馬 康

(1.廣州市計量檢測技術(shù)研究院,廣東廣州 510030;2.中國計量科學(xué)研究院化學(xué)所,北京 100013)

液相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜法準(zhǔn)確測定人血清中葡萄糖含量

申玉星1,全 燦2,馬 康2

(1.廣州市計量檢測技術(shù)研究院,廣東廣州 510030;2.中國計量科學(xué)研究院化學(xué)所,北京 100013)

以D-[13C6]葡萄糖標(biāo)記物作為內(nèi)標(biāo),用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定血清中的葡萄糖含量。向室溫平衡后的血清樣品中加入葡萄糖標(biāo)記物,用乙醇沉淀蛋白,低溫離心去除蛋白,上清液過0.22μm有機(jī)濾膜。采用LC/MS電噴霧離子源(ESI),正離子模式,選擇離子監(jiān)測模式進(jìn)行檢測。方法的線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5,加標(biāo)回收率為100.1%～102.8%,檢出限為8μg/kg,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差0.49%。該方法的樣品前處理簡單,測定準(zhǔn)確高、精密度好,可用于血清中葡萄糖含量的高準(zhǔn)確度定值。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;同位素稀釋質(zhì)譜法;血清;葡萄糖

血糖含量測定是臨床檢驗中最重要的指標(biāo)之一,它可為糖尿病、高血壓以及心腦血管系統(tǒng)等疾病的診斷、療效觀察、病程監(jiān)測、疾病預(yù)防等提供客觀依據(jù)[1]。血清葡萄糖常用的檢測方法主要有氧化酶-偶聯(lián)比色法、微電流法、氧速率法、己糖激酶法、鄰甲苯胺法、葡萄糖脫氫酶法、微創(chuàng)測定法和同位素稀釋質(zhì)譜法(IDM S)等[2]。同位素稀釋質(zhì)譜法是微量、痕量和超痕量物質(zhì)含量的權(quán)威測量方法[3]。測定血清中葡萄糖含量的同位素稀釋質(zhì)譜法主要是氣相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜(GC-IDM S)法和液相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜(LC-IDM S)法,前者主要通過沉淀去蛋白后衍生化來進(jìn)行檢測[4-6],樣品前處理過程相對復(fù)雜,但較LC-IDM S法的研究更加成熟。文獻(xiàn)報道主要有正離子模式加Na+、Cs+、N H4+[7-9]和負(fù)離子模式加 Cl-、I-[10-11]等。LC-IDMS法去除蛋白后可直接進(jìn)樣檢測,不用衍生化,操作簡單。采用LC-IDM S法對血清葡萄糖含量高準(zhǔn)確度定值的研究尚不夠成熟,相關(guān)研究報道較少。

本實驗在利用 GC-IDM S法準(zhǔn)確測定血糖含量的基礎(chǔ)上[3,6],研究建立LC-IDM S法定量血糖含量。實驗包括配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、標(biāo)記葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液以及校準(zhǔn)曲線混合溶液,向血清樣品中加入D-[13C6]葡萄糖標(biāo)記物作為內(nèi)標(biāo),乙醇沉淀蛋白后低溫離心,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算,通過LC-IDM S儀測定血清中葡萄糖含量。

1 實驗部分

1.1 實驗原理

利用LC-IDM S法測定血清中葡萄糖含量,配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、標(biāo)記葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液以及校準(zhǔn)曲線混合溶液,向血清樣品中加入D-[13C6]葡萄糖標(biāo)記物作為內(nèi)標(biāo),利用乙醇沉淀蛋白后低溫離心,取上層清液,過0.22μm有機(jī)濾膜進(jìn)行測定。

1.2 儀器與試劑

1200液相色譜儀,6410串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀:美國安捷倫公司產(chǎn)品;Xbridge Am ide色譜柱(3.5μm×4.6 mm ×150 mm):美國 Waters公司產(chǎn)品;M ettler Toledo XP26分析天平(最大感量22 g,d=0.001 mg):瑞士梅特勒公司產(chǎn)品;G-560E渦旋振蕩器(Scientific Industries);3K15離心機(jī)(Sigma);0.22μm針筒式微孔濾膜過濾器。

冰凍混合人血清:由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所提供;D-葡萄糖純度標(biāo)準(zhǔn)品(純度為99.5%):美國Sigma公司產(chǎn)品;D-[13C6]葡萄糖標(biāo)記物(同位素豐度大于99.9%):英國 Cambridge Isotope Laboratories產(chǎn)品;疊氮化鈉(分析純),乙腈(色譜純):德國 Merck公司產(chǎn)品;無水乙醇(分析純):美國J.T.Baker公司產(chǎn)品;氨水(分析純):汕頭市西隴化工有限公司產(chǎn)品;醋酸銫(純度為99%):Acros Organics;實驗用水為娃哈哈純凈水。

1.3 樣品試樣制備

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液、標(biāo)記葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

由于血清樣品中沒有添加任何抗菌劑,應(yīng)盡量避免樣品接觸空氣導(dǎo)致微生物引起的葡萄糖含量變化,為此,添加一定體積的0.1%疊氮化鈉溶液有助于血清樣品的長期儲存。精確稱量一定質(zhì)量的純度標(biāo)準(zhǔn)品,溶入一定體積的疊氮化鈉溶液中,濃度的計算應(yīng)考慮純度標(biāo)準(zhǔn)品的純度。精確稱量一定質(zhì)量的標(biāo)記物純品D-[13C6]葡萄糖溶入一定體積的疊氮化鈉溶液中,標(biāo)記物溶液在-20℃下冷藏,備用的標(biāo)記物溶液在4℃冰箱中儲存,該溶液在低溫下可穩(wěn)定2周。

1.3.2 校準(zhǔn)曲線混合溶液配制 根據(jù)血清樣品中葡萄糖的大致濃度,用質(zhì)量法配制。移取100 μL葡萄糖標(biāo)記物標(biāo)準(zhǔn)溶液(稱質(zhì)量),分別加入不同體積的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(稱質(zhì)量),配制葡萄糖與標(biāo)記葡萄糖質(zhì)量比值分別為0.75、0.85、0.95、1.05、1.15、1.25,輕搖混勻、充分平衡 ,分別加入1 m L無水乙醇,渦旋混勻。

1.3.3 血清樣品制備 待血清樣品室溫平衡后,稱取一定質(zhì)量(100μL)的血清樣品,稱取前輕搖混勻,且于下層吸取防止吸入氣泡。根據(jù)血清樣品中葡萄糖的大致濃度,向樣品中加入100 μL葡萄糖標(biāo)記物標(biāo)準(zhǔn)溶液(稱質(zhì)量),輕搖平衡。向已添加標(biāo)記物的樣品中加入1 m L無水乙醇[12],振蕩混勻,在4 ℃下以5 000 r/min離心10 min除去蛋白,取上層清液,過0.22μm有機(jī)濾膜。

1.4 回收率及檢出限的測定

取50μL血清樣品,添加50μL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,加入100μL標(biāo)記葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液后按上述處理方法處理,測定回收率。取一定量葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,用無水乙醇稀釋,制得0.1 mg/kg葡萄糖樣品溶液,以3倍信噪比計算檢出限。

1.5 色譜及質(zhì)譜條件

1.5.1 色譜條件 1)Xbridge Amide色譜柱:3 μm×2.0 mm×150 mm(Waters);流動相:V(乙腈)∶V(水(0.1%NH4OH))=55∶45的混合溶液;流速 0.4 m L/m in;柱溫 40 ℃。2)Luna amion色譜柱:3.5μm×4.6 mm ×150 mm(Phenomenex);流動相 :V(乙腈) ∶V(水(40 μmol/L Cs+))=80∶20的混合溶液;流速0.2 mL/min;柱溫35℃。3)ZARBOX RX-SIL色譜柱:5μm ×2.1 mm ×150 mm(Agilent);流動相:V(乙腈)∶V(水)=50∶50的混合溶液;流速0.3 m L/min;柱溫40 ℃。4)Xbridge Amide色譜柱:3.5μm×4.6 mm×150 mm(Waters);流動相:V(乙腈)∶V(水)=55∶45的混合溶液;流速0.4 m L/m in;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量5μL。本實驗選擇最優(yōu)色譜條件4進(jìn)行血清樣品測定。

1.5.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI),正離子模式,干燥氣溫度 300℃,干燥氣流速 10 L/min,霧化氣壓力 206.7 kPa,毛細(xì)管電壓3 500V,碎裂電壓135 V,駐留時間200 m s。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜與質(zhì)譜條件的優(yōu)化

葡萄糖是右旋糖,屬D構(gòu)型,在水溶液中主要以呋喃式構(gòu)型含氧環(huán)存在,為α和β兩種構(gòu)型的衡態(tài)混合物。一般用于分離糖類的色譜柱填料,主要為氨基柱或含氨基的聚合物柱,但由于氨基易流失,造成儀器噪聲較高,不利于葡萄糖的檢測。且葡萄糖的兩種構(gòu)型同時存在,色譜柱分離時易出現(xiàn)雙峰,需提高水相比例或升高溶液的p H值進(jìn)行改善,但提高水相比例不利于分離。本實驗優(yōu)化了色譜柱,選擇Xbridge Amide色譜柱,儀器噪聲小,靈敏度高,同時優(yōu)化了流動相比例。葡萄糖經(jīng)液相色譜質(zhì)譜正離子模式檢測時易加成Na+和NH4+,加成 Na+的準(zhǔn)分子不易碎裂,具有較高的靈敏度,但會形成少量的[2M+Na]+,示于圖1。提高碎裂電壓至135 V時,可有效降低[2M+Na]+的形成,示于圖2。

選擇加N H4+準(zhǔn)分子峰作監(jiān)測時,一是由于系統(tǒng)中的Na+很難完全去除,干擾加NH4+準(zhǔn)分子峰的定量;二是由于一般干燥氣溫度在300℃以上,加NH4+準(zhǔn)分子峰易形成較強(qiáng)的脫水峰和脫氨峰,示于圖3。

選擇加Cs+準(zhǔn)分子峰作監(jiān)測時,由于Cs+本身為大離子,對溫度較敏感,不易形成加成物,只有干燥氣在80～100℃時才有較好的信噪比[8],同時也有來自Na+的干擾,示于圖4。本實驗中未考察負(fù)離子模式下加Cl-、I-的準(zhǔn)分子作為監(jiān)測離子的條件。

本實驗選擇加Na+準(zhǔn)分子作為監(jiān)測離子,并優(yōu)化了質(zhì)譜條件,對血清樣品進(jìn)行檢測,示于圖5～7。由圖可以看出,葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品和血清樣品中,葡萄糖色譜峰的保留時間為6.1 min,具有較高的靈敏度。

圖1 加標(biāo)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在碎裂電壓為50 V時的質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectrum of spiked glucose standard in the fragmentor voltage of 50 V

圖2 加標(biāo)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在碎裂電壓為135 V時的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrum of spiked glucose standard in the fragmentor voltage of 135 V

圖3 加標(biāo)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品選擇加NH4+準(zhǔn)分子峰作監(jiān)測時的質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectrum of NH4+attachment

圖4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品選擇加Cs+準(zhǔn)分子峰作監(jiān)測時的質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectrum of Cs+attachment

圖5 加標(biāo)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品總離子流色譜圖(a)和加標(biāo)血清樣品總離子流色譜圖(b)Fig.5 TIC of spiked glucose standard(a)and TIC of spiked serum samples(b)

圖6 加標(biāo)血清樣品的選擇離子色譜圖Fig.6 SIM of spiked serum samples

圖7 加標(biāo)血清樣品的質(zhì)譜圖Fig.7 Mass spectrum of spiked serum samples

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、加標(biāo)回收率及最低檢出限

在葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品與標(biāo)記葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量比為0.75～1.25時,峰面積比和質(zhì)量比呈良好的線性關(guān)系,示于圖8。線性相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 5,加標(biāo)回收率為100.1%～102.8%。以3倍信噪比作為檢出限,測得此方法的檢出限為8μg/kg。

2.3 血清中葡萄糖含量的測定

取5瓶1#血清樣品進(jìn)行測定,結(jié)果列于表1,取3瓶2#血清樣品,每瓶取2個平行樣,每個樣進(jìn) 2針,取平均值,結(jié)果列于表 2。測得1#、2#血糖濃度分別為1 115.9、1 089.1 mg/kg,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.47%、0.49%。

表1 1#血清樣品中葡萄糖含量Table 1 Analytical results of serum glucose 1#(n=5)

表2 2#血清樣品中葡萄糖含量Table 2 Analytical results of serum glucose 2#(n=3)

圖8 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品與標(biāo)記葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品峰面積比與質(zhì)量比對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.8 The corresponding standard curve of peak area ratio to themass ratio of standard glucose to labeled glucose standard

3 結(jié)論

本實驗利用液相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜法測定血清中葡萄糖的含量,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.49%,加標(biāo)回收率為100.1%～102.8%,檢出限為8μg/kg。該方法樣品前處理簡單,測定準(zhǔn)確高、精密度好,可用于血清中葡萄糖含量的高準(zhǔn)確度定值。

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Accurate Determination of Serum Glucose by Liquid Chromatography-Isotope Dilution Mass Spectrometry

SHEN Yu-xing1,QUAN Can2,MA Kang2

(1.Guangzhou Institute of Measuring and Testing Technology,Guangzhou 510030,China;2.Division of Metrology in Chemistry,National Institute of Metrology,Beijing 100013,China)

A high performance liquid chromatography tandem mass spectrometric method w as established for the determination of glucose concentration in serum with the aid of D-[13C6]glucose internal standard.D-[13C6]glucose was added to the serum samp le in balance at room temperature.Then the protein was precipitated and extracted in anhydrous ethanol with centrifugation at low temperature.The supernatant w as filtered through a 0.22μm syringe filter into HPLC vials.Identification was achieved by electro-spray ionization(ESI)in positive mode using SIM mode.The calibration curve of glucose showed good linearity with correlation coefficient ofR2=0.999 5,recoveries of spiked samples were in the range 100.1%to 102.8%,the detection limit of the method was 8μg/kg(S/N=3),and the relative standard derivations were 0.49%.The established method is simple,accurate and precise,is appropriate for the determination of serum glucose with great accuracy.

liquid chromatography-tandem mass spectrometry;isotope dilution mass spectrometry;serum;glucose

全 燦(1977～),男(漢族),湖南人,博士,副研究員,從事化學(xué)計量相關(guān)研究。E-mail:superfluidcan@hotmail.com

O 657.63

A

1004-2997(2011)04-0211-05

2010-10-11;

2010-12-21

國家質(zhì)檢總局食品安全專項(21-ASPAQ1101),國家科技支撐計劃項目(2009BA K61B02),中國計量科學(xué)研究院基礎(chǔ)科學(xué)研究項目(21-AJDYX1116)資助

申玉星(1981～),男(漢族),山東人,碩士研究生,化學(xué)計量專業(yè)。E-mail:yxshenoo@163.com