周大煒,劉 斌,吳俊麗,胡 波,齊源遠(yuǎn)

(1.南開大學(xué)泰達(dá)生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457;2.天津市微生物功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457;3.南開大學(xué)分子微生物學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457)

糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)的基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜法監(jiān)測

周大煒1,2,3,劉 斌1,2,3,吳俊麗1,2,3,胡 波1,齊源遠(yuǎn)1

(1.南開大學(xué)泰達(dá)生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457;2.天津市微生物功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457;3.南開大學(xué)分子微生物學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457)

以w abD(大腸桿菌O77中O抗原基因簇內(nèi))編碼的α-1,3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶、w fgD(大腸桿菌O152中O抗原基因簇內(nèi))編碼的β-1,3-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶和w feD(志賀氏菌鮑氏O14中O抗原基因簇內(nèi))編碼的β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶酶促反應(yīng)產(chǎn)物為研究對象,嘗試應(yīng)用碰撞誘導(dǎo)解離 (CID)負(fù)離子模式基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜 (MALD I-TOFM S)技術(shù)建立簡單、高效的糖基轉(zhuǎn)移酶監(jiān)測方法。該方法首先直接用質(zhì)譜分析0.3μL未經(jīng)色譜分離、除鹽處理的反應(yīng)混合物,隨后應(yīng)用CID串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對酶活反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征,實(shí)現(xiàn)酶活反應(yīng)的快速檢測。研究結(jié)果表明,CID MALD I-TOFMS平臺(tái)適用于新建克隆的糖基轉(zhuǎn)移酶酶活反應(yīng)的監(jiān)測,與現(xiàn)有的高通量方法相比,在速度、靈敏度、重現(xiàn)性、自動(dòng)化和溶劑消耗方面具有絕對優(yōu)勢。

脂寡糖;糖基轉(zhuǎn)移酶;基質(zhì)輔助激光解吸離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD I-TOFMS)

糖基轉(zhuǎn)移酶是負(fù)責(zé)催化合成系列糖復(fù)合物(如糖蛋白、糖脂和蛋白多糖中的糖苷鍵)的一類重要的酶。糖基轉(zhuǎn)移酶的催化作用對于蛋白和脂翻譯后修飾的糖基化反應(yīng)至關(guān)重要,顯著影響各種各樣的分子-識別過程:如細(xì)菌/病毒感染、細(xì)胞黏著、免疫響應(yīng)、細(xì)胞分化、生長和控制及很多其他細(xì)胞間的通訊和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn),一些細(xì)菌中的糖基轉(zhuǎn)移酶和宿主中相對應(yīng)的糖基轉(zhuǎn)移酶有結(jié)構(gòu)上的同源區(qū)域[1],這是細(xì)菌為了逃避動(dòng)物和人的免疫系統(tǒng),其表面帶有一些與人或動(dòng)物細(xì)胞的糖鏈具有相似結(jié)構(gòu)的結(jié)果。對合成這些糖的糖基轉(zhuǎn)移酶的研究將對醫(yī)療和生物制藥有著重要的意義。

盡管糖基轉(zhuǎn)移酶有如此重要的作用和功能,但是從國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀來說,對糖基轉(zhuǎn)移酶的研究手段并不成熟,表現(xiàn)在現(xiàn)有超過20 000種已知序列可能編碼此類酶的基因中(http://afmb.cnrs-m rs.fr/CAZY/),僅有不到5%的假定糖基轉(zhuǎn)移酶基因的特定功能,在純化制備酶促反應(yīng)產(chǎn)物的基礎(chǔ)上,應(yīng)用核磁共振(NM R)技術(shù)得到了明確鑒定[2-3],關(guān)于這種多樣性的細(xì)節(jié)所知甚少。

原則上,一個(gè)糖鏈的完整結(jié)構(gòu)僅從NMR實(shí)驗(yàn)的綜合就可以推導(dǎo)出來,這已成為糖基轉(zhuǎn)移酶基因功能鑒定的首選方法[2-3]。但其主要缺點(diǎn)是靈敏度較低,特別是涉及耗時(shí)的分離純化制備步驟?；|(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD I-TOF M S)能測定完整的糖鏈分子質(zhì)量,同時(shí)還可以應(yīng)用碰撞誘導(dǎo)解離(CID)技術(shù)進(jìn)行寡糖序列測定,而且MALD I-TOFM S技術(shù)已成功用于多種酶的酶活監(jiān)測[4-5]。因此,結(jié)合已知糖類生化合成途徑的專業(yè)知識,可以勝任糖基轉(zhuǎn)移酶酶活的監(jiān)測和初步表征工作。本工作以本實(shí)驗(yàn)室前期應(yīng)用NM R技術(shù)已證明其基因功能的3個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶:w abD編碼的α-1,3-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(大腸桿菌 O77)、w fgD編碼的β-1,3-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶 (大腸桿菌 O152)和w feD編碼的β-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(志賀氏菌鮑氏O14)的酶促反應(yīng)產(chǎn)物為研究對象,其化學(xué)結(jié)構(gòu)示于圖1,嘗試通過MALD I-TOF MS技術(shù)分析酶活產(chǎn)物的形成,并在進(jìn)一步應(yīng)用 CID MALD I-TOF MS技術(shù)對酶活產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征的基礎(chǔ)上,建立新的簡單、高效、靈敏和準(zhǔn)確的糖基轉(zhuǎn)移酶活性監(jiān)測方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(4700 Proteomics Analyzer):美國 App lied Biosystem s公司產(chǎn)品。甲醇、乙腈(色譜純):美國Fisher 公 司 產(chǎn) 品;α-氰 基-4-羥 基 肉 桂 酸(α-CHCA):美國 Fluka 公司產(chǎn)品;水為二次重蒸水;GDP-M an、UDP-Glc和 UDP-Gal:購自Sigma-A ldrich公司;本實(shí)驗(yàn)涉及的菌株、質(zhì)粒、酶及其他生化試劑參見文獻(xiàn)[6]。

圖1 大腸桿菌O77,O152和志賀氏菌鮑氏O14 O抗原的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The O-antigen structures of E.coliO77,O152 and S.boydiiO14

1.2 酶活反應(yīng)

大腸桿菌O77和O152抗原中w abD基因、w fgD基因和志賀氏菌鮑氏O14抗原中w feD基因的克隆、含相應(yīng)重組質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)及酶活反應(yīng)細(xì)胞膜提取物的制備按文獻(xiàn)[4]方法進(jìn)行。由于w fgD、w feD和w abD與細(xì)胞膜之間存在相互作用,本工作利用含w abD或w fgD或w feD基因的重組質(zhì)粒細(xì)胞膜部分作為酶的來源進(jìn)行酶促反應(yīng)。

標(biāo)準(zhǔn)40μL反應(yīng)體系為:1 mmol/L受體GlcNAc-PP-PhU(空白對照以二次重蒸水替代),5 mmol/L M nCl2,75 mmol/L M ES buffer(p H 7),5 mmol/L GDP-M an(或UDP-Glc,或UDP-Gal)和10μL細(xì)菌膜提取物(含1～12 μg蛋白質(zhì),陰性對照分別以大腸桿菌DH5α和BL 21替代)。37℃水浴中反應(yīng)15 min后,沸水浴中加熱 3 m in,以 12 000 r/min離心 5 m in。將上清液稀釋200倍后,取0.3μL待測液與等體積基質(zhì),滴于質(zhì)譜靶樣品點(diǎn)心,室溫干燥,結(jié)晶后直接分析測試。

w abD酶促反應(yīng)產(chǎn)物(Man-α-1,3-GlcNAcα-PO3-PO3-(CH2)11-OPh),w fgD酶促反應(yīng)產(chǎn)物 (Glc-β-1,3-GlcNAc-α-PO3-PO3-(CH2)11-OPh)和w feD酶促反應(yīng)產(chǎn)物(Gal-β-1,4-Glc-NAc-α-PO3-PO3-(CH2)11-OPh)的化學(xué)結(jié)構(gòu)示于圖2。

1.3 MALD I-TOFMS分析條件

基質(zhì)為α-CHCA,激光器 Nd:YAG,波長355 nm,反射模式,負(fù)離子譜檢測。串聯(lián)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)中,高能碰撞誘導(dǎo)解離(CID)碰撞小室內(nèi)空氣為碰撞氣體,其壓力維持在3.33×10-4Pa,碰撞能量1 kV。為質(zhì)譜解析方便,暫且把預(yù)期的酶促反應(yīng)產(chǎn)物——苯氧基十一烷基二磷酸二糖當(dāng)成五糖(寡糖),苯氧基十一烷基和二磷酸基相應(yīng)地分別代表1個(gè)和2個(gè)糖環(huán)。所有碎片應(yīng)用Domon-Costello命名法識別[7]。

圖2 wab D(a),w f g D(b)和w fe D(c)酶促反應(yīng)產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 The structures of w ab D product(a),w f g D product(b)and w f e D product(c)

2 結(jié)果與討論

2.1 wab D、w f g D和w fe D酶活性的質(zhì)譜監(jiān)測

在負(fù)離子模式下,分別利用含w abD、w fgD、w feD基因的重組質(zhì)粒和大腸桿菌BL21(不含質(zhì)粒)的細(xì)胞膜部分作為酶的來源進(jìn)行酶促反應(yīng),MALD I-TOFM S譜圖示于圖3。這里,以w abD催化反應(yīng)產(chǎn)物為例(圖3c),豐度強(qiáng)的準(zhǔn)分子離子峰m/z789.304 6[M-H]-與M an-GlcNAc-PP-PhU的分子質(zhì)量相對應(yīng),顯示w abD具有明顯的甘露糖轉(zhuǎn)移酶活性;而以大腸桿菌BL 21(不含質(zhì)粒)的細(xì)胞膜作為酶活反應(yīng)的陰性對照(圖3a)和以水代替給予體底物(圖3b)進(jìn)行酶促反應(yīng)的空白對照在酶活檢測中均完全沒有相應(yīng)的糖基轉(zhuǎn)移酶活性。證明反應(yīng)中的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活性由含有w abD基因的質(zhì)粒產(chǎn)生。

同理可以證明:w fgD(圖 3d)和w feD(圖3e)反應(yīng)中的葡萄糖和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性分別由含有w fgD和w feD基因的質(zhì)粒產(chǎn)生。

到目前為止,已報(bào)道的糖基轉(zhuǎn)移酶酶活性監(jiān)測方法有放射性薄層層析法,色譜法[8],光譜法和質(zhì)譜法[9]。這些方法或者需要放射性標(biāo)記的給予體底物,或底物和產(chǎn)物都需要含發(fā)色團(tuán),或者需要特別的樣品前處理(質(zhì)譜法),普遍存在耗時(shí)長、實(shí)驗(yàn)程序繁瑣等缺陷。本工作建立的MALD I-TOF M S分析法涉及的樣品前處理僅需加熱除蛋白和適當(dāng)?shù)南♂屘幚?從酶促反應(yīng)開始到獲得最終的質(zhì)譜結(jié)果,整個(gè)過程不超過30 min。

2.2 wab D、w f g D和w fe D酶活性的初步表征

圖4、5和6分別給出了負(fù)離子模式下w abD、w fgD和w feD反應(yīng)產(chǎn)物分子離子的二級質(zhì)譜圖。這里以w abD催化反應(yīng)產(chǎn)物為例,以m/z789.304 9[M-H]-為前體離子,觀察到4個(gè)源于磷酸二脂鍵部分碎裂的MS2產(chǎn)物離子,分別為m/z444.574 9[B3],m/z524.626 5[B4],m/z462.603 4[C3]和m/z405.549 1[Z3];源于糖苷鍵斷裂的產(chǎn)物離子有m/z241.296 6[Y4]和m/z423.569 9[Y3];m/z79.173 9[PO3]-和m/z159.097 9[HPO3PO3]-源于磷酸二脂鍵部分2個(gè)鍵的同時(shí)碎裂;未發(fā)現(xiàn)涉及開環(huán)的產(chǎn)物離子。

酶促反應(yīng)產(chǎn)物二級質(zhì)譜圖中的 Y型離子,即m/z241.296 6[Y4]和m/z423.569 9[Y3]源于糖苷鍵的斷裂,表明酶促反應(yīng)產(chǎn)物二糖的連接序列為M an-GlcNAc-PP-PhU。

w f gD(圖5)和w feD(圖 6)反應(yīng)產(chǎn)物分子離子的二級質(zhì)譜圖中的碎片離子組成同w abD(圖4)基本一致,表明3種酶活產(chǎn)物的裂解機(jī)理相似。同理可以證明,相應(yīng)的酶促反應(yīng)產(chǎn)物二糖的連接序列分別為 Glc-GlcNAc-PP-PhU和Gal-GlcNAc-PP-PhU。

圖 3 陰性對照(a)、空白對照(b)、wab D(c)、w f g D(d) 和w f e D(e)催化產(chǎn)物的MALD I-TOFMS譜圖Fig.3 MALD I-TOFMS spectrum of negative con trol(a)、blank control(b)、wab D product(c)、w f g D product(d)and w fe D product(e)

圖4 wab D催化反應(yīng)產(chǎn)物的CID MALD I-TOFMS譜圖Fig.4 CID MALD I-TOFMS spectrum of wab D product MS2 of m/z 789.304 9

圖5 w f g D催化反應(yīng)產(chǎn)物的CID MALD I-TOFMS譜圖Fig.5 CID MALD I-TOFMS spectrum of w f g D product MS2 of m/z 789.303 4

圖6 w fe D催化反應(yīng)產(chǎn)物的CID MALD I-TOFMS譜圖Fig.6 CID M ALD I-TOFMS spectrum of w f e D product MS2 of m/z 789.307 4

3 結(jié)論

本工作研究了負(fù)離子模式下3種酶活產(chǎn)物(w abD基因、w fgD基因和w feD基因編碼的)混合物的 MALD I-TOF M S和 CID MALD ITOF M S質(zhì)譜表征,結(jié)果表明,w abD基因、w fgD基因和w feD基因分別具有葡萄糖、甘露糖和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性,這與已獲得的2DNM R(600 M Hz)分析結(jié)果一致。本工作建立的簡單、靈敏、快速、準(zhǔn)確酶活監(jiān)測手段和酶活性初步表征方法,對O-抗原生物合成路徑中細(xì)菌糖基轉(zhuǎn)移酶基因功能的高通量篩選具有普遍適用性,將為重組疫苗和應(yīng)用生物技術(shù)大規(guī)模合成功能性糖鏈奠定基礎(chǔ)。

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Monitoring of Glycosyltransferase Reactions by MALD I-TOFMass Spectrometry

ZHOU Da-wei1,2,3,L IU Bin1,2,3,
WU Jun-li1,2,3,HU Bo1,Q I Yuan-yuan1
(1.TEDA School of Biological Sciences and Biotechnology,N ankai University,Tianjin 300457,China;2.The Engineering and Research Center for Microbial Functional Genom ics and Detection Technology,Ministry of Education,Tianjin 300457,China;3.The Key Laboratory of Molecular Microbiology and Technology,Ministry of Education,Tianjin 300457,China)

Novel gram-negative bacteria have lipopolysaccharides terminating in repeating oligosaccharides which comp rise the O-antigen.The glycosyltransferases(GTs)assembling the O-chain utilize lipid-linked acceptor substrates and nucleotide sugar donor substrates.However,the lack of a rapid and simplemethod for monitoring glycosyltransferase activity p reclude the elucidation of the function of putative GTs.Mass spectrometry is a rapid,sensitive,and accurate approach for the direct monito ring of enzyme-catalyzed reactions that does not require a chromopho re or radiolabeling and thus provides a viable alternative to ex-

isting analytical techniques.In this study,a simple and efficient assay for glycosyltransferase activity by matrix-assisted laser desorp tion-ionization(MALD I)mass spectrometry with collision-induced dissociation(CID)was demonstrated byw abD(in E.coli O77 O-antigen gene cluste)enzymatic reaction,w fgD(in E.coli O152 O-antigen gene cluste)enzymatic reaction andw feD(in S.boydii O14 O-antigen gene cluste)enzymatic reaction,respectively.The rapid and direct detection of the enzymatic reaction w as achieved by subjecting a small amount(0.3μL)of the reaction mixture to M S analysis without chromatographic separation or desalting steps,and subsequent M S-M S analyses of the product via collision-induced dissociation enabled the structures of products of enzyme-catalyzed reactions to be determined.Collectively,these data demonstrate that CID MALD I-TOF M S based platform is applicable to the facile determination of the enzymatic activity of other new ly cloned glycosyltransferases and offers significant advantages over current H T Smethods in terms of speed,sensitivity,reproducibility,automation and reagent costs.

glucosyltransferase;lipooligosaccharide;matrix-assisted laser desorption-time of flight mass spectrometry(M ALD I-TOF M S)

O 657.63

A

1004-2997(2011)04-0193-07

2010-11-30;

2011-03-09

南開大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動(dòng)資金(No.J02006)資助

周大煒(1966～),女(漢族),吉林通化人,副研究員,功能基因組學(xué)專業(yè)。E-mail:daweizhou@nankai.edu.cn