郝光濤,曲恒燕,李媛媛,朱力軍,馬 蒙,劉澤源

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院藥理室,北京 100071;2.蚌埠醫(yī)學(xué)院,安徽蚌埠 233030)

HPLC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)定量測定人血漿中氫可酮

郝光濤1,曲恒燕1,李媛媛1,朱力軍2,馬 蒙2,劉澤源1

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院藥理室,北京 100071;2.蚌埠醫(yī)學(xué)院,安徽蚌埠 233030)

建立 HPLC-M S/M S方法定量測定人血漿中氫可酮濃度。以地西泮為內(nèi)標(biāo),采用甲醇-0.05%甲酸水溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫,以Agilent-C18(2.1×50 mm×3.5μm)色譜柱為分析柱,通過電噴霧離子源(ESI),以正離子多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式進(jìn)行檢測。用于定量分析的離子對分別為m/z300.2→199.1(氫可酮)和m/z285.0→193.0(地西泮,內(nèi)標(biāo))。氫可酮線性范圍為0.5～50μg/L,定量下限為0.5μg/L(n=6),日內(nèi)、日間精密度的RSD均小于15%,平均回收率大于75%。本方法專屬性強、樣品處理簡便、靈敏度高,適用于氫可酮臨床藥動學(xué)研究。

氫可酮;液湘色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法;血漿藥物濃度

重酒石酸氫可酮是由美國Robins公司研究開發(fā)的一種半合成的阿片類鎮(zhèn)痛止咳藥,屬阿片受體的完全激動劑,不會逆轉(zhuǎn)或拮抗同時應(yīng)用的其他激動劑的作用。該藥用于緩解中度疼痛,還可用于止咳。其結(jié)構(gòu)與可待因相似,鎮(zhèn)痛強度、鎮(zhèn)靜作用、止咳作用強于可待因,副作用與可待因相當(dāng)。該化合物發(fā)現(xiàn)很早,其片劑或復(fù)方制劑在國外已大量用于臨床,原料和部分制劑品種已被美國藥典收載。近年來該藥主要與其他成分配伍使用(如氫可酮酒石酸鹽與偽麻黃素、撲而敏等配伍),其臨床的主要用途為癌癥患者的止痛劑、牙痛的止痛劑及鎮(zhèn)靜止咳。

文獻(xiàn)[1-2]采用液-液萃取,固相萃取的方式處理血漿樣品,血漿用量分別為500、300μL,定量下限為0.1μg/L,血漿用量大、處理步驟多、操作較為繁瑣、且成本高。本實驗采用沉淀蛋白后揮干的方法處理血漿樣品,梯度洗脫的方式提高檢測信號。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀:日本島津公司產(chǎn)品,其中高效液相色譜系統(tǒng)包括二元輸液泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱;串聯(lián)質(zhì)譜儀為 API 3200型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀,含電噴霧離子化源以及串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜檢測器;色譜工作站:美國AB公司產(chǎn)品,配有Analyst 1.4.2數(shù)據(jù)處理軟件;GL-88B旋渦混合儀:海門市其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品;AB104電子分析天平:瑞士Mettler Toledo公司產(chǎn)品;Sigma 2K-15型高速低溫離心機:美國Sigma公司產(chǎn)品;M illi-Q Plus純水器:美國密理博中國有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要試劑

重酒石酸氫可酮標(biāo)準(zhǔn)品(批號:171262-2007,純度99.7%),地西泮對照品(內(nèi)標(biāo),批號:1230-9601,純度99.0%):由中國藥品生物制品檢定所提供;甲醇、乙腈(色譜純):D IMA公司產(chǎn)品;實驗用水為去離子水,實驗室自制;其余試劑均為分析純;空白人血漿:由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院血液科提供。

1.3 HPLC-MS/MS分析條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱:Agilent-C18柱(2.1×50 mm ×3.5μm);流動相:甲醇-0.05%甲酸水溶液;梯度洗脫:0～1.5 m in,20%A,1.5～1.6 m in,20%～75%A,1.6～3.6 m in,75%A,3.6～3.7 min,75%～20%A,3.7～6.5 min,20%A;流速 :0.35 m L/min;柱溫 :室溫 ;進(jìn)樣量10μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件 離子源:電噴霧離子化源(ESI源);正離子模式檢測;離子監(jiān)測方式:多反應(yīng)監(jiān)測(M RM)方式;噴射電壓:4 000 V;離子源溫度:350℃;源內(nèi)氣體1(GS1,N2)壓力:207 kPa;源內(nèi)氣體2(GS2,N2)壓力:413.7 kPa;碰撞電壓:19 V;裂解電壓:160 V。以多反應(yīng)監(jiān)測的質(zhì)譜掃描方式分析,測定氫可酮和內(nèi)標(biāo)的正離子對分別為m/z300.2→199.1、m/z285.0→193.0,示于圖 1。

圖1 氫可酮(a)和內(nèi)標(biāo)地西泮(b)的產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖Fig.1 M RM chromatograms of[M+H]+for hydrocodone(a)and diazepam(b)

1.4 實驗步驟

1.4.1 樣品預(yù)處理 精密量取50μL血漿樣品,置于1.5 m L EP試管中,加入50μL內(nèi)標(biāo)溶液(5μg/L地西泮甲醇溶液)、補加1 050μL甲醇溶液,渦旋混合均勻,以15 000 r/m in于4 ℃離心10 min,取上清液800μL于40℃水浴中氮氣揮干,以150μL純水復(fù)溶,進(jìn)樣 10μL,進(jìn)行HPLC-MS/M S分析。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品的制備 取50μL空白血漿,依次加入50μL氫可酮標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和50μL內(nèi)標(biāo),配制成相當(dāng)于血漿濃度為0.5、1、2.5、10、25、40 和 50μg/L 血漿樣品 ,每點為 5樣本,按照1.4.1項所描述方法進(jìn)行處理并測定,同樣步驟再次配制1、10、40μg/L 3種濃度的質(zhì)控樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 特異性考察

分別取6個不同受試者的50μL空白血漿進(jìn)行實驗,實驗所得血漿中氫可酮和內(nèi)標(biāo)地西泮的典型質(zhì)量色譜圖示于圖2。除不加內(nèi)標(biāo)溶液并另外補加50μL甲醇外,其余按血漿樣品分析方法處理,進(jìn)樣10μL,獲得空白樣品的色譜圖,示于圖2a;將一定濃度的氫可酮標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)地西泮溶液加入空白血漿中,依同法進(jìn)行樣品處理,獲得相應(yīng)的色譜圖,示于圖2b(最低定量限)和圖2c(標(biāo)準(zhǔn)曲線中間濃度);取受試者給藥后收集的血漿樣品,依同法進(jìn)行樣品處理,獲得相應(yīng)的色譜圖,示于圖2d。結(jié)果表明,空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾氫可酮和地西泮的測定。

圖2 血漿中氫可酮(I)和內(nèi)標(biāo)地西泮(II)的典型M RM質(zhì)量色譜圖Fig.2 M RM chromatograms of hydrocodone(I)and diazepam(IS)(II)

2.2 絕對基質(zhì)效應(yīng)考察

取50μL空白血漿,依次加入50μL氫可酮標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和50μL內(nèi)標(biāo),配制成相當(dāng)于血漿濃度為1、10、40μg/L的血漿樣品,每點為3樣本,按1.4.1項操作,取10μL進(jìn)行LC-M S/M S分析,記錄色譜圖峰面積A1;用50μL純水代替50μL血漿,按以上方法操作(每個濃度1份),記錄色譜圖峰面積A2。

按照下述公式計算得基質(zhì)效應(yīng)(M E%),M E%=A1/A2×100%。

1、10、40 μg/L 3種濃度的絕對基質(zhì)效應(yīng)分別為(100.00±6.49)%、(93.07±16.76)%、(94.68±8.28)%。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

以待測化合物和內(nèi)標(biāo)峰面積為縱坐標(biāo),血漿中待測物濃度為橫坐標(biāo),權(quán)重系數(shù)1/X2,進(jìn)行線形回歸計算,得標(biāo)準(zhǔn)曲線,示于圖3。線形相關(guān)系數(shù)r為0.997 6,而且各點標(biāo)示濃度和計算濃度的偏差都在 ±15%以內(nèi)(最低定量限為±20%),最低定量濃度為0.5μg/L。

圖3 HPLC-MS/MS法測定人血漿中氫可酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 A typital calibration curve for determination hydrocodone in human plasma by HPLC-MS/MS

2.4 定量下限

定量下限為0.5μg/L,按1.4.1項操作,制備氫可酮的0.5μg/L質(zhì)量控制(QC)樣品6樣本分析,定量下限為(0.45±0.045)μg/L,定量下限的準(zhǔn)確度為(90.80±7.62)%。

2.5 精密度和準(zhǔn)確度

方法學(xué)考核樣品為1、10、40μg/L 3種濃度,n=6,方法學(xué)考核批次為3次,結(jié)果列于表1。結(jié)果表明,此方法的精密度和準(zhǔn)確度偏差均在±15%以內(nèi)。

表1 重酒石酸氫可酮回收率和精密度Table 1 Recovery and precision of hydrocodone

2.6 穩(wěn)定性

在不同的實驗條件下(-40℃反復(fù)凍融3次、血漿室溫放置4 h、-40℃下凍存1個月、檢測樣品室溫放置20 h穩(wěn)定性)對質(zhì)控樣品進(jìn)行穩(wěn)定性實驗(n=3)。

1)-40℃反復(fù)凍融3次穩(wěn)定性:質(zhì)控樣品在-40℃冰箱中完全冷凍后,取出在室溫環(huán)境下解凍,然后再次放入冰箱,如此反復(fù)3次后制備并測定。

2)血樣室溫放置4 h穩(wěn)定性:質(zhì)控樣品在室溫下放置4 h后制備并測定。

3)冷凍保存1個月穩(wěn)定性:質(zhì)控樣品在-40℃下避光保存,1個月后制備并測定。

4)檢測樣品室溫放置20 h穩(wěn)定性:質(zhì)控樣品在室溫放置20 h后制備并測定。

以上4種情況下的穩(wěn)定性(n=3)結(jié)果列于表2,可見,氫可酮在這4種條件下的穩(wěn)定性良好。

表2 氫可酮穩(wěn)定性Table 2 Stability of hydrocodone

2.7 方法應(yīng)用

應(yīng)用本方法的雙周期自身交叉實驗設(shè)計,單劑量口服給藥測定24名中國成年健康受試者單劑量口服505 mg氨酚氫可酮片(含5 mg重酒石酸氫可酮)不同時間血漿中氫可酮的濃度,并計算藥代動力學(xué)參數(shù)。本研究方案已通過軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),受試者在參加實驗前必須簽署知情同意書。合格的受試者被隨機分配到2個實驗組,每組12名。每組受試者每次實驗時分別服用受試制劑或參比制劑,平均血藥濃度-時間曲線示于圖4。藥代動力學(xué)參數(shù)結(jié)果如下:Cmax:(22.93±6.45)μg/L;t1/2(ke):(5.43±0.99)h;AUC0-tn:(128.59±32.75)(μg ·h)/L;AUC0-μ :(135.43 ±34.05)(μg·h)/L。

圖4 24名健康志愿者口服5 mg重酒石酸氫可酮后的平均血藥濃度-時間曲線Fig.4 Mean plasma concentration-time profile of amycin in 24 healthy volunteers after oral administration of 5 mg hydrocodone

3 討論

本實驗建立的血漿中重酒石酸氫可酮的HPLC-MS/M S測定法,血漿中雜質(zhì)不干擾樣品的測定,標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.5～50μg/L,線性關(guān)系良好;高、中、低3個濃度的批內(nèi)和批間精密度均小于15.0%;相對回收率在100.83%～106.35%之間;重酒石酸氫可酮血漿樣品室溫放置4 h、-40℃下反復(fù)凍融3次、-40℃下凍存一個月及檢測樣品室溫放置20 h條件下穩(wěn)定性良好,符合生物樣品分析要求。本實驗采用沉淀蛋白后揮干的方法處理血漿樣品,操作簡單、節(jié)約成本,適合大批藥代動力學(xué)樣本測定;實驗采用了梯度洗脫的方式,提高了檢測信號,從而提高了靈敏度,每個樣品僅用50μL血漿,大大減少了臨床試驗采集受試者的血液量,便于臨床試驗的開展并且有利于保護(hù)受試者權(quán)益;實驗最低定量限為0.5μg/L,完全滿足臨床本研究藥代數(shù)據(jù)的需要(Cmax:22.93±6.45μg/L)。

[1]ZHANG R,WANGB J,WEIC M,et al.Determination and pharmacokinetic study of hydrocodone in human plasma by liquid chromatography coup led with tandem mass spectrometry[J].2009,37(5):203-207.

[2]CHEN Y L,HANSON GD,JIANG X Y,et al.Simultaneous determination of hydrocodone and hydromo rphone in human plasma by liquid chromatography with tandem mass spectrometric detection[J].Journal of Chromatography B,2002,769:55-64.

[3]向 平,沈 敏,沈保華,等.生物檢材中嗎啡類生物堿的LC-MS/MS分析[J].法醫(yī)學(xué)雜志,2006,22(1):52-54.

[4]M A TUSZEW SKIB K,CONSTANZER M L,CHAVEZ-ENG C M.Strategies for the assessment of matrix effect in quantitative bioanalytical methods based on HPLC-MS/MS[J].Anal Chem,2003,75(13):3 019-3 030.

[5]鐘大放.以加權(quán)最小二乘法建立生物分析標(biāo)準(zhǔn)曲線的若干問題[J].藥物分析雜志,1996,16(5):343-346.

Determination of Hydrocodone in Human Plasma by High Performance Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

HAO Guang-tao1,QU Heng-yan1,L I Yuan-yuan1,ZHU Li-jun2,MA M eng2,L IU Ze-yuan1
(1.A ffiliated Hospital,Academy of M ilitary M edical Sciences,Beijing 100071,China;2.Bengbu M edical College,Bengbu 233030,China)

HPLC-M S/M S method was established for the determination of hydrocodone in human plasma.Diazepam was used as internal standard,methanol-0.5%formic acid water w as used as the mobile phase for gradient elution,Agilent-C18 colum n(2.1×50 mm×3.5 μm)was used as analytical column.Electrospray ionization(ESI)source was app lied,and multiple reaction monito ring(M RM)mode wasoperated in the positivemode with themonitor ions atm/z300.2→199.1 for hydrocodone andm/z285.0→193.0 for the internal standard,respectively.The linear calibration curve is obtained over the concentration range of 0.5—50μg/L.The limit of quantitation is 0.5μg/L(n=6).The inter and intra-day precision(RSD)is less than 15%.The average recoveries are above 75%.The method is p roved to be specific,convenient,sensitive and suitable for pharmacokinetics of hydrocodone.

hydrocodone;HPLC-M S-M S;plasma concentration

劉澤源(1961～),男(漢族),山西太原人,主任藥師,從事新藥I期臨床研究。E-mail:13311010528@189.cn

O 657.63

A

1004-2997(2011)04-0252-05

2010-09-13;

2011-05-24

郝光濤(1980～),男(漢族),甘肅慶陽人,藥師,從事新藥I期臨床研究。E-mail:13146323056@m165.com