徐英江，張世娟，宮向紅，

劉慧慧1，2，鄧旭修3，張華威3，張秀珍1，2

（1.山東省海洋水產研究所，山東 煙臺 264006；2.山東省海洋生態(tài)修復重點實驗室，山東 煙臺 264006；3.煙臺山水海產有限公司，山東 煙臺 264006）

凝膠滲透色譜凈化－氣相色譜－質譜法測定水產品中的溴酚類化合物

徐英江1，2，張世娟1，2，宮向紅1，2，

劉慧慧1，2，鄧旭修3，張華威3，張秀珍1，2

（1.山東省海洋水產研究所，山東 煙臺 264006；2.山東省海洋生態(tài)修復重點實驗室，山東 煙臺 264006；3.煙臺山水海產有限公司，山東 煙臺 264006）

建立了水產品中溴酚類化合物的氣相色譜－質譜分析方法。樣品中的溴酚類化合物經酸化后，用正己烷－乙醚混合溶液提取，凝膠色譜凈化，乙酸酐衍生后，用正己烷提取衍生產物，在選擇離子模式下用氣相色譜－質譜法進行測定。結果表明，溴酚類化合物在DB-17ms色譜柱上得到良好的分離，色譜峰出峰尖銳，沒有雜峰干擾。乙酸酐衍生后極大地提高了溴酚類化合物在檢測器上的響應，靈敏度也較衍生前提高近百倍。本方法檢出限為0.3～0.5μg/kg，在添加濃度為0.3～5.0μg/kg范圍內，回收率為70.2%～102%，相對標準偏差為5.2%～10.3%。通過對市場上常見的水產品進行分析，發(fā)現溴酚類化合物的含量在0.56～4.44μg/kg之間，其中2，4，6-三溴苯酚的含量最高。

凝膠色譜凈化；水產品；溴酚類化合物；氣相色譜－質譜

近年來，以2－溴苯酚、4-溴苯酚、2，4-二溴苯酚、2，6-二溴苯酚、2，4，6-三溴苯酚為代表的海洋中溴化物受到越來越多的關注。溴酚類化合物是半揮發(fā)性物質，有著強烈的氣味，具有調味的性質，被認為是魚類、軟體動物、甲殼類和藻類等海產品中關鍵風味化合物的重要組成部分。溴酚類物質具有非常低的感覺閾限（ng/g），當其以低濃度存在時，能夠產生一種令人愉悅的海洋風味或者提高海產品中已有的風味；而當其以高濃度存在時，則能產生令人不快的氣味，從而使海產品質量下降［1］。海產品風味的特性和強度取決于其含有的溴酚單體類型、濃度及其所處的海洋環(huán)境的特性。據資料顯示，所有的野生對蝦中，溴酚總含量在9.5～1 114ng/g之間，其含量因對蝦的種類、地點和捕獲季節(jié)的不同而不同［2］，而人工養(yǎng)殖的水產品多數不含有這幾種溴酚，因此也就缺乏可以與野生水產品相媲美的海洋風味。人們試圖在餌料中添加溴酚類物質以使得人工養(yǎng)殖的水產品具有海洋風味，但是目前很少有人能夠成功的做到這一點。無論是在餌料中添加溴酚還是其鹽類，都無法提高其在人工養(yǎng)殖海產品中的含量［2］。人工養(yǎng)殖的魚蝦獲取溴酚的唯一途徑就是進食含有高濃度天然溴酚的魚蝦以及海洋蠕蟲。而有研究表明，海洋蠕蟲因其高濃度的溴酚含量已經對海洋沉積物造成了污染，甚至對深海底層生物群落的結構和活性造成很大影響［3］。因此建立靈敏快捷的溴酚檢測方法不僅能為海產品的風味研究提供依據，還能夠及時地對溴酚類化合物的海洋污染進行監(jiān)控。

目前溴酚類化合物的測量方法多數采用液相色譜法和氣相色譜－質譜法［1，4］。多數方法采用的前處理過程均為酸化后放置12h以上，然后進行水蒸氣蒸餾，之后用GC或GC/MS進行分析。水蒸氣蒸餾樣品消耗量大、前處理過程時間長、效率低，而溴酚類物質不加衍生直接進行氣相色譜分析靈敏度較低。本研究采用在水浴中酸化條件下，正己烷－乙醚混合溶液提取、GPC凝膠凈化、乙酸酐衍生的方法，測定水產品中的溴酚類化合物，并對市場上的常見海產品進行分析。

1 實驗部分

1.1 主要試劑

2-溴 苯 酚 （2-bromophenol，2-BP，純 度 ≥98%）、2，4-二溴苯酚（2，4-dibromophenol，2，4-DBP，純度≥98%）、2，6-二溴苯酚（2，6-dibromophenol，2，6-DBP，純度≥99%）、2，4，6-三溴苯酚（2，4，6-tribromophenol，2，4，6-TBP，純 度 ≥99%）標準品：美國Sigma-Aldrich公司產品；4-溴苯酚（4-bromophenol，4-BP，純度≥98%）標準品：瑞士Fluka公司產品；衍生試劑：乙酸酐（分析純）；正己烷、環(huán)己烷和二氯甲烷均為農殘級試劑；乙醚為色譜純；實驗用水均為超純水。

1.2 實驗儀器

6890N/5973i氣相色譜－質譜儀：美國 Agilent公司產品；Milli-Q Gradient純水儀：法國Millipore公司產品；TGL-10C離心機：上海安亭儀器有限公司產品；N-EVAPTM112氮吹儀：美國Organomation Associates公司產品；Laborota 4001旋轉蒸發(fā)儀：德國Heidolph公司產品；AccuPrepTM凝膠滲透色譜系統(tǒng)：美國J2Scientific公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理 稱取4.0g勻漿后樣品于離心管中，加入12mL硫酸水溶液，振蕩混勻，60℃水浴恒溫30min，冷卻后加10mL V（正己烷）∶V（乙醚）＝9∶1溶液，振搖提取10 min，離心后取上清液于梨形瓶中，殘渣再加入10mL正己烷－乙醚混合溶液，重復提取1次，合并上清液，于40℃旋轉蒸發(fā)至近干，用10mL V（乙酸乙酯）∶V（環(huán)己烷）＝1∶1溶液溶解殘留物，GPC進行凈化，紫外檢測波長254nm，以V（乙酸乙酯）∶V（環(huán)己烷）＝1∶1溶液為流動相，流速4.72mL/min，收集10～15min的洗脫液。

1.3.2 衍生化 洗脫液于40℃旋轉緩慢蒸發(fā)至干，加入2mL甲醇溶解殘留物，再加入3mL 0.1mol/L碳酸鉀溶液和100μL乙酸酐，漩渦混合1min進行衍生化反應，加入1mL正己烷提取衍生產物，無水硫酸鈉脫水后，供GC/MS分析。

1.3.3 氣相色譜－質譜法測定 DB-17MS毛細管柱（30m×0.25mm×0.25μm），載氣為高純氦氣（純度＞99.999%）；進樣口溫度300℃，恒流模式（1.0mL/min），不分流進樣，進樣量1μL；升溫程序：起始溫度100℃，保持2min，以10℃/min升至200℃，再以20℃/min升至280℃，保持4min。

電子轟擊源（EI），電離能70eV；電離能離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；接口溫度280℃；溶劑延遲5min；測定模式為選擇離子監(jiān)測（SIM）模式，溴酚類物質衍生物的特征離子列于表1。

表1 溴酚衍生物的特征離子Table 1 Characteristic ions of bromophenol compounds

2 結果與討論

2.1 提取試劑的選擇

分別實驗了乙酸乙酯、正己烷、乙醚、正己烷－丙酮溶液、正己烷－乙醚溶液和石油醚－乙醚溶液的提取效果，結果發(fā)現，乙酸乙酯和乙醚對5種溴酚化合物幾乎完全回收；V（石油醚）∶V（乙醚）＝7∶3溶液只能提取其中的2種物質；正己烷、正己烷－丙酮溶液、正己烷－乙醚溶液能夠同時提取5種溴酚化合物，其中以正己烷－乙醚混合溶液的提取效果最好。另外，本工作研究了正己烷和乙醚的混合溶液不同體積比對提取效率的影響，結果發(fā)現，V（正己烷）∶V（乙醚）＝9∶1溶液的提取效果最好，因此選擇V（正己烷）∶V（乙醚）＝9∶1的溶液作為提取試劑。

2.2 提取方法的選擇

傳統(tǒng)的溴酚提取方法均為水蒸氣蒸餾，需要的樣品量較大，一般為幾十到幾百克樣品加入到1L水中，酸化后進行水蒸氣蒸餾提取，樣品消耗大且不易實現批量分析。本研究試驗了將樣品pH值調至1之后，靜置過夜，然后加入提取試劑進行提取，再用乙酸酐衍生分析，發(fā)現直接加標樣品回收良好，但在做實際樣品時，測定結果偏低，回收率均低于50%?？赡苁且驗樗峄潭炔粔驅е落宸尤杂胁糠忠越Y合態(tài)存在，不能夠被完全提取，導致測量值偏低。為使溴酚類物質能夠充分地轉化成分子態(tài)，本研究采用加入硫酸水溶液，并用水浴加熱的酸化方式，發(fā)現效果良好，回收率得到了較大的提高，均能達到70%以上。

2.3 凈化條件的選擇

水產品基質復雜，需要經過有效的凈化步驟以消除脂肪、色素等雜質的影響［5－6］。濃硫酸磺化凈化方法簡單、效果顯著，常用于氯代苯系物的前處理過程。本研究試驗了濃硫酸磺化對溴酚的凈化效果，結果發(fā)現，經濃硫酸凈化后的譜圖干凈，二溴苯酚、三溴苯酚的回收率良好，但是對4－溴苯酚幾乎無回收。經研究發(fā)現，4-溴苯酚溶于濃硫酸，因此濃硫酸磺化無法作為5種溴酚化合物的同時凈化方法。弗羅里硅土和氧化鋁小柱對水產品有良好的凈化效果，經過實驗發(fā)現，采用弗羅里硅土凈化的譜圖干凈，但洗脫液在氮吹濃縮時損失較大，一溴苯酚無回收。考慮到水產品尤其是蝦類產品中脂肪色素含量較大，而GPC凝膠凈化系統(tǒng)能夠有效地去除這類雜質的特性，本研究選用GPC凝膠凈化系統(tǒng)，實驗表明，凈化效果明顯，回收率高，結果列于表2。

表2 凈化方式對回收率的影響Table 2 Influence of purification method to recovery

2.4 水浴溫度對提取效率的影響

為使樣品酸化充分并加快酸化速度，實驗采用水浴加熱酸化，實驗過程發(fā)現，當水浴溫度為80℃時，2-溴苯酚的回收率僅為50%。對5種溴酚化合物的性質分析發(fā)現，2-溴苯酚的飽和蒸汽壓大，87.3℃時已經達到1.73kPa，高溫下2－溴苯酚有很大一部分變成氣體逸出，因此水浴過程中應避免高溫，但低溫易造成樣品酸化不充分，經過優(yōu)化最終選擇水浴溫度為60℃，既能保證樣品充分酸化又不會造成2－溴苯酚的過多損失。因此實驗過程中應保持溫度小于60℃，且所有濃縮步驟的速度應保持緩慢，否則也會造成2－溴苯酚的損失，水浴溫度對提取效率的影響列于表3。

表3 水浴溫度對提取效率的影響Table 3 Influence of water bath temperature to extraction efficiency

2.5 衍生化對相應信號的影響

溴酚類物質若不經衍生直接進樣，靈敏度低，經乙酸酐衍生后靈敏度提高近百倍，示于圖1。

圖1 衍生反應對靈敏度的影響Fig.1 Influence of derivatization on signal sensitivity

2.6 衍生試劑的選擇

研究了硅烷化試劑，七氟丁酸酐和五氟丙酸酐、乙酸酐的衍生化效果，結果表明，乙酸酐的衍生效果最好，不需加熱，毒性小，最終選用乙酸酐作為衍生化試劑。經乙酸酐衍生后的選擇離子流圖示于圖2。

圖2 溴酚類的選擇離子流圖Fig.2 SIM chromatogram of bromophenols

2.7 定量標準曲線

配制濃度分別為1.0、5.0、10.0、50.0、100 μg/L溴酚混合標樣，衍生后在SIM模式下進行定量檢測。以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線，結果表明，各組分皆能保持良好的線性關系，列于表4。

表4 各組分的標準曲線Table 4 The calibration curve of five bromophenols

2.8 回收率、精密度與檢出限

以蝦為研究對象，考察了方法的回收率與精密度。在空白樣品中添加4種不同濃度的溴酚類物質標準溶液，按照本方法進行回收率實驗，每個濃度重復測定6次，計算其回收率和精密度，結果列于表5。從表5可以看出，在加標濃度0.3～5μg/kg范圍內，方法的平均回收率為70.2%～102%，相對標準偏差為5.2%～10.3%。分別在空白樣品中添加溴酚類物質，按信噪比大于3計算其檢出限，信噪比大于10計算定量下限，結果列于表5。

2.9 樣品分析

對市場上常見的南美白對蝦和中國對蝦進行測定，其中在南美白對蝦（淡水）中均未檢出溴酚類物質，南美白對蝦（海水）、中國對蝦中均檢出溴酚類物質，結果列于表6。

表5 方法的加標回收率、相對標準偏差、檢出限與定量下限（n＝6）Table 5 Spiked recoveries，relative standard deviations，limits of detection and limits of quantification of bromophenols

表6 水產品中溴酚含量Table 6 Bromophenols concentrations in fishery product

3 結論

本研究建立了水產品中溴酚類化合物的氣相色譜－質譜測定方法，樣品消耗少、處理方法簡單，采用乙酸酐衍生化反應能有效提高方法的靈敏度。本方法檢出限為0.3～0.5μg/kg，在添加水平0.3～5.0μg/kg范圍內，回收率為70.2%～102%，相對標準偏差為 5.2% ～10.3%，適用于水產品中溴酚類化合物的測定。

［1］DA SILVA V M，DA CUNHA VELOSO M C，DE OLIVEIRA A S，et al.Determination of simple bromophenols in marine fishes by reversephase high performance liquid chromatography（RP-HPLC）［J］. Talanta，2005，68 （2）：323-328.

［2］WHITFIELD F B，HELIDONIOTIS F，SMITH D.Role of feed ingredients in the bromophenol content of cultured prawns［J］.Food Chemistry，2002，79（3）：355-365.

［3］LINCOLN D E，FIELMAN K T，MARINELLIB R L，et al.Bromophenol accumulation and sedi-ment contamination by the marine annelids Notomastus lobatus and Thelepus crispus［J］.Biochemical Systematics and Ecology，2005，33（6）：559-570.

［4］徐繼林，嚴小軍，徐年軍，等.海產品中溴酚類海洋風味素的氣相色譜－質譜聯用分析［J］.水產學報，2004，28（1）：100-105.

［5］徐英江，任傳博，田秀慧，等.海產品中硝基呋喃類原藥的超高效液相色譜串聯質譜測定［J］.分析測試學報，2010，29（4）：327-330.

［6］徐英江，宮向紅，張秀珍，等.超高效液相色譜－串聯質譜測定海水及沉積物中三聚氰胺［J］.質譜學報，2009，30（2）：70-73.

Determination of Bromophenols in Fishery Product by GPC and GC/MS

XU Ying－jiang1，2，ZHANG Shi-juan1，2，GONG Xiang-hong1，2，LIU Hui-hui1，2，DENG Xu-xiu3，ZHANG Hua-wei3，ZHANG Xiu-zhen1，2
（1.Marine Fisheries Research Institute of Shandong Province，Yantai 264006，China；2.Shandong Province Key Laboratory of Restoration for Marine Ecology，Yantai 264006，China；3.Yantai Shanshui Seafood Co.Ltd，Yantai 264006，China）

A method for the analysis of bromophenols in fishery product was developed.The sample was acidified to make sure that all of the bromophenol compounds were converted to molecular status.The molecular bromophenol was extracted by n-hexane-ethylether，purified by GPC，acetylize by acetic anhydride，and then extracted by n-hexane and determined by GC/MS.The result indicated that all of the bromophenol compounds were finely separated on the DB-17ms column with good chromatographic peak，and the derivatization with acetic anhydride was enhanced the signal sensitivity by almost a hundred times.The detection limit is 0.3—0.5μg/kg，with recoveries of 70.2%—102%and relative standard devia-tions of 5.3%—10.3%.The proposed method is applied to the analysis of bromophenol in fishery product，and it is found that the bromophenol contents are between 0.3μg/kg and 5.0μg/kg，among which 2，4，6-TBP has the highest level.

GPC；fishery product；bromophenols；GC/MS

O 657.63

A

1004-2997（2011）06-0350-05

2011-03-24；

2011-09-26

海洋公益性行業(yè)科研專項經費資助項目（200805031），海洋公益性行業(yè)科研專項經費資助項目（201105013），山東省水生動物營養(yǎng)與飼料泰山學者崗位資助項目

徐英江（1979～），男，山東濰坊人，助理研究員。

張秀珍。E-mail：zxz0535501＠126.com

book=366,ebook=140