高 照，張亦農(nóng)

（國家體育總局中國反興奮劑中心，北京 100029）

抗凝血藥物是國際馬術(shù)聯(lián)合會(huì)（International Equestrian Federation，F(xiàn)EI）禁用藥物名錄中的一類藥物[1]，由于香豆素類及茚酮類抗凝血藥物具有生物活性且廣泛存在于天然產(chǎn)物中，近年來有關(guān)該類物質(zhì)的臨床應(yīng)用和毒性引起了人們的普遍關(guān)注。歐洲食品安全局在對動(dòng)物肝中毒實(shí)驗(yàn)的非顯著性不良效應(yīng)水平研究基礎(chǔ)上，規(guī)定了人每日可承受的最大攝入量為0.07 mg/kg[2]。目前針對該類藥物主要采用液相色譜法進(jìn)行藥物毒理和體內(nèi)代謝方面的研究，對幾種藥物，尤其是雙香豆素和苯茚二酮類的液相色譜－質(zhì)譜（LC－MS/MS）測定方法的研究較少[3－4]。HPLC－MS/MS法靈敏度高、專屬性和特異性好，是近年來興奮劑檢測方法主要的發(fā)展方向[5]。本實(shí)驗(yàn)通過固相萃取凈化等手段純化和富集樣品，運(yùn)用HPLC－MS/MS進(jìn)行快速分析和篩查，并對該類化合物的電噴霧離子化裂解途徑進(jìn)行歸納，建立能夠同時(shí)快速篩查和定量測定飼料中該類藥物的方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

Agilent 6410LC－MS/MS系統(tǒng)（1200binary快速液相，6410/2k－A三重四極桿質(zhì)譜儀）：美國Agilent公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)：美國Sigma公司產(chǎn)品；渦旋振蕩器：Scientific Industry公司產(chǎn)品；固相萃取裝置：美國 Waters公司產(chǎn)品；Milli－Q純水系統(tǒng)：美國Millipore公司產(chǎn)品。

雙香豆素（dicoumarin）和雌三醇（IS）：購自中國藥品生物制品檢定所；醋硝香豆素（acenocoumarin）、苯茚二酮（phenidione）、芐丙酮香豆素（warfarin）、香豆素（coumarin）：均購自上海安譜科學(xué)儀器有限公司。雙香豆素使用氯仿溶解，其他標(biāo)準(zhǔn)品使用甲醇溶解，各配制1g/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分別用甲醇稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液制備系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。甲醇、乙腈、乙酸乙酯（色譜純）：均購自沃凱公司；氯仿、高氯酸（分析純）：購自北京試劑公司；乙酸胺（色譜純）：購自Baker公司；MCX固相萃取柱（150mg）：美國 Waters公司產(chǎn)品。

1.2 儀器實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1 色譜及質(zhì)譜條件 色譜柱：Zorbax SB C18柱（2.1mm×100mm×3.5μm）；柱溫30℃；流速2.5mL/min；流動(dòng)相 A：10mmol/L乙酸銨水溶液；流動(dòng)相B：乙腈溶液；干燥氣溫度320℃；干燥氣流速12L/min；霧化器壓力2.794×105Pa；毛細(xì)管電壓：3 500V（＋）/3 000V（－）；流動(dòng)相梯度為：0～2min、20%B，2～10 min、20～28%B，10～10.01min、28%～90%B；10.01～15min，90%B；Post run：6min；進(jìn)樣量10μL。5種藥物及內(nèi)標(biāo)MRM優(yōu)化的采集參數(shù)列于表1。

表1 MRM檢測模式下5種藥物優(yōu)化的質(zhì)譜條件Table 1 The optimized conditions of MRM detection for five anticoagulants

1.2.2 樣品預(yù)處理 精確稱量（1.00±0.02）g經(jīng)粉碎的飼料于50mL具塞離心管中，加入100 μL 1μg/L雌三醇內(nèi)標(biāo)，靜置1h后準(zhǔn)確加入4.0mL甲醇，渦旋振蕩2min后超聲20min，然后以9 000r/min冷凍（－4℃下）離心10min，吸取上清液于另一50mL離心管中，再向殘?jiān)屑尤?6mL 0.02mol/mL NaOH 溶液，渦旋振蕩5min后，相同條件下冷凍離心，合并2次提取溶液后加入40μL高氯酸溶液調(diào)節(jié)pH 4，渦旋振蕩2min后以4 000r/min離心5min。上清液通過Oasis MCX（150mg/6mL）萃取小柱（依次用6mL甲醇、6mL水活化）凈化，離心管底層白色膠狀蛋白沉淀用1mL甲醇、5mL水洗滌后，離心后一同過柱。5mL 15%甲醇水淋洗后，20mm Hg負(fù)壓下抽干3min，用5mL V（氯仿）∶V（異丙醇）＝5∶1的混合溶液洗脫。收集洗脫液于50℃下氮?dú)獯蹈桑?00μL V（甲醇）∶V（水）＝1∶1的混合溶液溶解后檢測。5種物質(zhì)定量下限及內(nèi)標(biāo)提取離子色譜圖示于圖1。

圖1 5種物質(zhì)定量下限及內(nèi)標(biāo)的提取離子色譜圖Fig.1 The extracted ion chromatography of all drugs at the level of lower limit of quantification

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜色譜條件優(yōu)化及稀釋溶劑的選擇

實(shí)驗(yàn)選用Zorbax SB C18色譜柱（2.1mm×100mm×3.5μm），5種藥物有較好的靈敏度和分離度，且相互間無明顯干擾。根據(jù)香豆素類藥物及茚二酮類藥物的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征，分別在正負(fù)模式下考察了5種藥物的質(zhì)譜響應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)香豆素在正離子模式下一級全掃描均有較好的響應(yīng)，主要為準(zhǔn)子離子峰[M＋H]＋，另外有較弱的[M＋Na]＋峰。其余的藥物均為在負(fù)離子模式下有較好的響應(yīng)，主要為準(zhǔn)分子離子峰[M－H]－。選擇性質(zhì)較為相似的雌激素雌三醇[6]作為內(nèi)標(biāo)。通過對不同碰撞能量下主要碎片離子的分析，對5種藥物的裂解途徑進(jìn)行解析，所選擇的主要離子與其結(jié)構(gòu)特征相符，保證了該類物質(zhì)定性分析的準(zhǔn)確性。每個(gè)待測物選取兩對豐度較大、基質(zhì)干擾小的離子對作為定量離子對和輔助定性離子對，采集分為5段，分別采用正負(fù)切換的離子掃描模式，各時(shí)間段內(nèi)通過優(yōu)化駐留時(shí)間保證定性定量的準(zhǔn)確度，使待測物選擇離子色譜峰上采集點(diǎn)不少于20個(gè)。實(shí)驗(yàn)比較了甲醇，甲醇水溶液（V（甲醇）∶V（水）＝1∶1），乙腈水溶液（V（乙腈）∶V（水）＝1∶1）作為復(fù)溶溶劑進(jìn)樣，結(jié)果表明，用甲醇水溶液（V（甲醇）∶V（水）＝1∶1）定容后，上樣各藥物峰型較好且響應(yīng)良好。

2.2 樣品預(yù)處理方法的優(yōu)化

目前針對幾類藥物的提取方法多采用加入酸性緩沖液后，用乙酸乙酯、氯仿等有機(jī)溶劑液液萃取[7－11]后濃縮進(jìn)樣，但賽馬飼料為植物性復(fù)合飼料，基質(zhì)較為復(fù)雜[12]，故選擇固相萃取提取凈化。有文獻(xiàn)報(bào)道Yu[13－14]等用反相混合型陽離子交換固相萃取柱對沉淀蛋白后賽馬血液中的違禁藥物進(jìn)行了提取凈化，以V（二氯甲烷）∶V（乙酸乙酯）＝4∶1的混合溶液洗脫中性和酸性藥物，以含2%濃氨水的V（乙酸乙酯）∶V（二氯甲烷）∶V（異丙醇）＝5∶4∶1的混合溶液洗脫堿性藥物，結(jié)果有較好的靈敏度和重現(xiàn)性?；诨衔锏男再|(zhì)（香豆素類藥物極微溶于醇和醚試劑，略溶于氯仿，而香豆素及茚二酮類在堿性溶液中易溶），實(shí)驗(yàn)了滲透組織能力較好的甲醇浸潤和沉淀蛋白后用0.02mol/LNaOH溶液提取5種藥物后，提取上清液經(jīng)陰離子交換混裝柱Oasis MAX凈化后，以2%甲酸乙腈溶液洗脫，結(jié)果表明，凈化后雙香豆素和芐丙酮香豆素的回收率均較低且波動(dòng)較大，這可能是由于香豆素類物質(zhì)在堿性環(huán)境下過柱時(shí)間較長發(fā)生不可逆開環(huán)，部分待測物降解造成的。在相同條件下提取上清液，用HClO4調(diào)pH值至弱酸性后，分別通過陽離子交換混裝柱Oasis MCX及Oasis HLB萃取柱凈化，結(jié)果顯示固相萃取柱HLB凈化后基質(zhì)干擾較多；MCX萃取柱凈化后用V（氯仿）∶V（異丙醇）＝5∶1溶液洗脫，5種藥物的回收率及重現(xiàn)性較好，空白提取樣品中相同時(shí)間不出現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)提取離子峰干擾的雜質(zhì)峰，凈化專屬性較強(qiáng)，且省去了有機(jī)試劑提取液過萃取柱凈化前的濃縮過程，故采用MCX萃取柱凈化，具體見1.2.2樣品預(yù)處理。

2.3 定量方法的建立

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及檢出限 準(zhǔn)確稱量6份（1.00±0.02）g空白飼料于50mL具塞離心管中，加入100μL 1mg/L內(nèi)標(biāo)試劑雌三醇試劑后，分別添加系列標(biāo)準(zhǔn)工作液制備醋硝香豆素，香豆素的質(zhì)量濃度分別為10、20、40、100、200、500ng/g；芐丙酮香豆素，雙香豆素的質(zhì)量濃度為20、40、80、200、500、800ng/g；苯茚二酮的質(zhì)量濃度為40、80、200、400、800、1 000ng/g的基質(zhì)加標(biāo)樣品。靜置1h后按1.2.2項(xiàng)進(jìn)行批處理，以飼料樣品中添加待測物濃度為橫坐標(biāo)，待測物與內(nèi)標(biāo)物的提取定量離子色譜峰面積比值為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸運(yùn)算得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，列于表2。制備系列質(zhì)量濃度空白加標(biāo)樣品經(jīng)預(yù)處理后連續(xù)進(jìn)樣，為保證定性定量的準(zhǔn)確性，以不低于10倍信噪比（S/N≥10）對應(yīng)的基質(zhì)添加濃度作為方法的檢出限，以不低于20倍信噪比（S/N≥20）對應(yīng)的基質(zhì)添加濃度作為方法的定量限，最終確定苯茚二酮的檢出限為15ng/g，定量限為40ng/g；香豆素和醋硝香豆素的檢出限為4ng/g，定量限為10ng/g；華法林和雙香豆素的檢出限為10ng/g，定量限為20ng/g；5種物質(zhì)定量下限及內(nèi)標(biāo)物提取離子色譜圖示于圖1。

表2 5種藥物的工作曲線，相關(guān)系數(shù)和定量下限Table 2 Linear range，correlation coefficient of calibration curves and LOQ of five drugs

2.3.2 方法的回收率，精密度及準(zhǔn)確度 制備5種藥物的低、中、高3個(gè)濃度的空白基質(zhì)加標(biāo)樣品，每一濃度進(jìn)行5樣本分析，以當(dāng)日隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣品的濃度，同時(shí)另取空白飼料（1.00±0.02）g，除不加內(nèi)標(biāo)溶液外，按1.2.2項(xiàng)的方法制備上清液，向固相萃取柱洗脫溶劑中加入等體積的內(nèi)標(biāo)溶液和相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液混合后，50℃下氮?dú)鈸]干，殘?jiān)?00μL V（甲醇）∶V（水）＝1∶1的混合溶液溶解后進(jìn)樣分析，獲得相應(yīng)峰面積（每個(gè)濃度5份樣品測定的平均值）。以每一濃度下兩份基質(zhì)加標(biāo)質(zhì)量濃度相同的樣品待測物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值計(jì)算相對回收率，結(jié)果列于表3。連續(xù)5天對相同的空白飼料低、中、高3個(gè)濃度加標(biāo)樣品進(jìn)行批處理，計(jì)算方法的日內(nèi)日間精密度和準(zhǔn)確度。結(jié)果表明，本方法測定馬飼料中5類抗凝血藥物的日內(nèi)精密度、日間精密度和準(zhǔn)確度良好，可以滿足檢測的要求，結(jié)果列于表4。

2.4 質(zhì)譜譜圖解析

5種藥物的主要碎片碎裂途徑的推測示于圖2～6。

雙香豆素的主要碎片離子為m/z 161.1的負(fù)離子，將碎裂能量加大至40eV得到較強(qiáng)的脫掉中性碎片CO后的m/z 117.0負(fù)離子。苯茚二酮的結(jié)構(gòu)中有2個(gè)羰基，分別失掉一個(gè)CO分子后得到m/z193.1和m/z164.9的負(fù)離子，加大碎裂能量到35eV時(shí)得到m/z 145.0的負(fù)離子，進(jìn)一步加大碎裂能量到40eV以上時(shí)得到m/z117.0的負(fù)離子，推斷分別為失掉C6H4中性分子和進(jìn)一步失掉CO后得到的碎片離子。

表3 5種藥物的加標(biāo)提取回收率Table 3 The relative recoveries of five drugs in feed（n＝5）

表4 5種藥物的日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度Table 4 Inter－day and intra－day assay accuracy and precision data for five drugs

芐丙酮香豆素的主要碎片m/z 250.1為脫掉丙酮奇電子離子后的負(fù)離子，當(dāng)碎裂能量達(dá)到25eV時(shí)出現(xiàn)明顯的m/z161.1離子峰，當(dāng)碎裂能量達(dá)到40eV以上時(shí)有明顯的m/z 117.0離子峰。香豆素分子在正離子模式下有更好的響應(yīng)，主要通過脫掉CO和CO2中性分子形成穩(wěn)定的帶有芳香性的m/z91.0和102.9的碳正離子。

圖2 雙香豆素的裂解過程Fig.2 Possible fragmentation pathway of dicoumarin

圖3 苯茚二酮的裂解過程Fig.3 Possible fragmentation pathway of phenidione

圖4 芐丙酮香豆素的裂解過程Fig.4 Possible fragmentation pathway of warfarin

圖5 香豆素的裂解過程Fig.5 Possible fragmentation pathway of counarin

圖6 醋硝香豆素的裂解過程Fig.6 Possible fragmentation pathway of acenocoumarin

醋硝香豆素響應(yīng)最強(qiáng)的碎片離子為m/z 265.1，推測為準(zhǔn)分子離子失去一分子O＝C＝CH－NO2。當(dāng)碎裂能量加到40eV以上時(shí)有明顯的 m/z 145.1離子峰，推測為失去一個(gè)C8H8O分子，另外還有較強(qiáng)的 m/z 161.1，117.1的離子峰。經(jīng)過中性丟失掃描（neutral loss）證實(shí)在碰撞能量達(dá)到20eV，MS1從260到360有一個(gè)明顯的質(zhì)量數(shù)87（C2HNO3）的中性碎片丟失，MS1從100到260有一個(gè)明顯的質(zhì)量數(shù)為120（C8H8O）的中性碎片丟失。上述結(jié)果表明，m/z161.1，117.1為4－羥基香豆素類抗凝血藥物的主要特征碎片，可作為該類抗凝血?jiǎng)┭苌锏奶卣骱Y查離子。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了馬飼料中的4種香豆素類抗凝血?jiǎng)┖?種茚二酮類抗凝血?jiǎng)┩瑫r(shí)快速篩查和定量分析的液相色譜－質(zhì)譜法，該方法的預(yù)處理較為便捷、高效，且有較好的專屬性、重現(xiàn)性和靈敏度，適用于復(fù)雜基質(zhì)中該類藥物的痕量分析和測定。

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