何永云，梁廣智，劉曉影，孫 巖，高玉光

(山東濰坊醫(yī)學院口腔醫(yī)學研究所，山東濰坊 261053)

Runx 2在牙釉質(zhì)形成中的作用研究

何永云，梁廣智，劉曉影，孫 巖，高玉光

(山東濰坊醫(yī)學院口腔醫(yī)學研究所，山東濰坊 261053)

目的:研究小鼠成釉細胞中Runx 2對釉成熟蛋白(Amelotin，AMTN)、成釉蛋白(Ameloblastin，AMBN)、牙成釉細胞相關(guān)蛋白(odontogenic ameloblast－asssociated protein，ODAM)基因表達的調(diào)控作用，為研究Runx 2在牙釉質(zhì)形成中的作用奠定基礎(chǔ)。方法:通過RT－PCR法從小鼠成釉細胞中克隆得到Runx 2全長基因，測序正確后將其亞克隆至pcDNA3.1－h(huán)isA載體中;構(gòu)建針對小鼠Runx 2的siRNA表達框架，將反應(yīng)質(zhì)粒pcdna－3.1－HisA－Runx2及針對Runx2的特異性小分子干擾RNA(siRNA)分別轉(zhuǎn)染小鼠成釉細胞，用RT－PCR方法檢測Runx 2，AMTN，AMBN以及ODAM的mRNA水平。結(jié)果:轉(zhuǎn)染的小分子干擾RNA(siRNA)對Runx 2 mRNA的表達有顯著性抑制作用，Runx 2基因沉默可顯著抑制AMTN和AMBN的mRNA表達水平;Runx 2基因過表達可顯著上調(diào)AMTN和AMBN的mRNA表達水平。Runx 2基因的表達變化對ODAM的mRNA表達水平則無顯著性調(diào)控作用。結(jié)論:Runx 2通過調(diào)控AMTN和AMBN的表達水平，在牙釉質(zhì)形成過程中發(fā)揮作用。

核心結(jié)合因子;釉成熟蛋白;成釉蛋白;牙成釉細胞相關(guān)蛋白;RT－PCR

［牙體牙髓牙周病學雜志，2011，21(2):62］

［Chinese Journal of Conservativedentistry，2011，21(2):62］

Runx 2稱為核心結(jié)合因子，又名Cbfal，在成骨細胞的分化中起著關(guān)鍵的作用，最近研究［1］顯示它也參與了牙齒發(fā)育的信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，Runx基因敲除小鼠可以導致牙胚鐘狀期發(fā)育不全，從而使新生小鼠牙齒特異性細胞的分化受阻，導致牙本質(zhì)異常和牙釉質(zhì)缺失。國內(nèi)外許多研究發(fā)現(xiàn)，在動物牙齒發(fā)育中cbfal的表達有時空特異性［2－3］。然而，迄今為止在人牙胚研究領(lǐng)域尚未發(fā)現(xiàn)進一步的報道。近來發(fā)現(xiàn)cbfal共有3種同形異構(gòu)體，他們均在牙胚中有表達［4］。本研究在小鼠成釉細胞中沉默及過表達 cbfal后，采用實時定量 PCR檢測AMTN、AMBN和ODAM的表達水平，確定cbfal對牙釉質(zhì)基質(zhì)蛋白的調(diào)控作用，為進一步研究其在成牙細胞分化和牙齒硬組織形成中的作用機制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

小鼠成釉細胞系(ALC，日本秋田大學Sugiyama［5］教授惠贈);RNAiso Plus(Total RNA 提取試劑)、PrimeScript? RT reagent Kit(Perfect Real Time)、T4dNA連接酶(TaKaRa公司);凝膠回收試劑盒及小量質(zhì)粒提取試劑盒(上海生物工程有限公司);Taq plus(QIAGEN公司，美國)，BamHⅠ、XbaⅠ及 HindⅢ(NEB公司，美國);pcDNA 3.1－HisA載體、pMD18－T simple 載體及 LipofectamineTM2000(Promega公司);SiRNA Transfection Reagent、SiRNA Transfection Medium(Santa Cruz公司)，DNA Marker#sm0331(Fermentas公司);SYBRgreen PCR Master Mix(Roche公司);IQ5TMPCR 儀(Bio－Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠Runx 2基因的克隆及重組表達載體的構(gòu)建

以傳至第3代的小鼠成釉細胞提取的總RNA為模板，用Oligo(dT)進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA第1條鏈，用上下游引物進行擴增。通過GenBank檢索小鼠Runx 2基因序列，根據(jù)引物設(shè)計原則，采用Primer 5.0軟件進行引物設(shè)計。上游引物P1為:5'－AAgGATCC ACATGCGTATTCCTGTAGATC－3'，含BamHⅠ的酶切位點;下游引物 P2為:5'－AA TCTAGA ATATGGCCGCCAAACAGACT－3'，含 XbaⅠ的酶切位點。PCR擴增Runx 2 cDNA為1 545 bp，將產(chǎn)物進行BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切并割膠回收，與經(jīng)相同酶切的pcDNA3.1－HisA空載體連接并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑單菌落培養(yǎng)抽提質(zhì)粒進行酶切鑒定，鑒定正確后送TaKaRa公司測序進一步驗證，測序正確即為構(gòu)建好的真核表達重組載體 pcDNA3.1－HisA－Runx 2。

1.2.2 雙鏈siRNA的制備

根據(jù)Elbashir等［6］提出的原則設(shè)計一對靶向Runx2基因的特異性雙鏈 siRNA(siRNA－Runx 2)，由TaKaRa公司合成，SDS－PAGE純化。合成一對無關(guān)siRNA作為陰性對照。

1.2.3 引物設(shè)計及PCR反應(yīng)

根據(jù)引物設(shè)計原則，采用Primer 5.0軟件設(shè)計Runx 2、AMTN 、AMBN、ODAM 以及gAPDH 的引物，PCR引物、擴增片段的長度及反應(yīng)條件(表1)。

表1 不同PCR反應(yīng)引物、擴增片段的長度及反應(yīng)條件

1.2.4 細胞培養(yǎng)、重組質(zhì)粒和雙鏈siRNA的瞬時轉(zhuǎn)染

成釉細胞用含100 mL/L小牛血清的DMEM培養(yǎng)基在含50 mL/L CO2、飽和濕度、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6孔板鋪板，每孔2×106/mL，待細胞融合至70%～80%時按照TransFastTMTransfectionReagent操作說明書進行空質(zhì)粒pcDNA3.1/myc－h(huán)isA 和 重 組 表 達 載 體pcDNA3.1－HisA－Runx 2 的轉(zhuǎn)染，每個樣本 3 個復孔。轉(zhuǎn)染36 h后，按RNAiso Plus試劑說明書抽提細胞總RNA，紫外分光光度計測RNA濃度和純度，取1 μg進行反轉(zhuǎn)錄。

1.2.5 免疫組織化學檢測Runx 2表達

取出生后5d小鼠下頜切牙甲醛固定，乙二胺四乙酸(EDTA)低溫脫礦后制作組織蠟塊，組織切片經(jīng)常規(guī)脫蠟入水，抗原修復后50 mL/L過氧化氫液或甲醇去除內(nèi)源性過氧化物酶活性，50 mL/L羊血清封閉非特異結(jié)合蛋白，滴加1∶50稀釋的一抗兔抗鼠Runx 2，4℃孵育過夜;1∶200 HRP標記的羊抗兔抗體室溫結(jié)合2 h;加DAB顯色，經(jīng)蘇木素復染、脫水、透明及封片后，顯微鏡下觀察結(jié)果。陰性對照用PBS代替一抗。

1.2.6 RT－PCR 檢測 Runx 2、AMTN、AMBN 及ODAM mRNA表達

以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進行實時定量PCR，反應(yīng)條件如表1所示。RT－PCR產(chǎn)物以CT值作為分析依據(jù)。因為pcDNA3.1－HisA∶Runx 2及siRNA對內(nèi)源性基因GAPDH無影響，故以GAPDH作為內(nèi)對照用以標準化樣本。CT值由熒光PCR儀在擴增過程中自動讀出。所得CT值結(jié)果進行2－△△CT分析［7］，ΔΔCt= 實驗組目的基因CT－管家基因CT－對照組目的基因CT－管家基因CT。2－△△CT示實驗組目的基因的表達相對于對照組的變化倍數(shù)，以計算Runx 2在成釉細胞中過表達及沉默后AMTN、AMBN及ODAM mRNA的表達相對變化。

1.3 統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較用配對t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 小鼠Runx 2基因的克隆及重組表達載體的構(gòu)建

以小鼠成釉細胞 cDNA為模板，P1、P2為引物，擴增出約1 545 bp的片段，大小同GenBank中報道的小鼠Runx 2 cDNA序列長度相符。構(gòu)建的pcDNA3.1－HisA－Runx 2 經(jīng)BamHⅠ和 HindⅢ雙酶切后得到一大片段和一697 bp小片段，DNA測序結(jié)果經(jīng)BLAST顯示結(jié)果與預(yù)期一致(圖1)。

2.2 小片段Runx 2、AMTN、AMBN 及ODAM 表達水平檢測

在體外培養(yǎng)的成釉細胞中RT－PCR檢測到Runx2、AMTN、AMBN及ODAM分別約為123 bp、132 bp、174 bp和110 bp的條帶，連接到T載體中測序分別為Runx 2、AMTN、AMBN及ODAM基因(圖2)。

2.3 Runx 2在小鼠下頜切牙成釉細胞中的表達

用抗Runx 2抗體進行5d齡小鼠的下頜骨免疫組化染色在成釉細胞胞核中見陽性表達，余為陰性(圖3)。

2.4 重組質(zhì)粒 pcDNA3.1－HisA－Runx 2及siRNA－Runx 2 轉(zhuǎn)染后 Runx 2、AMBN、AMTN 及ODAM mRNA表達變化

通過對所得CT值結(jié)果進行2－△△CT分析，成釉細胞中轉(zhuǎn)染Runx2 siRNA 24 h后Runx2 mRNA表達水平下降約60%，差異有顯著性，說明Runx2基因的沉默效果較好。AMBN、AMTN及ODAM在轉(zhuǎn)染Runx 2 siRNA組表達水平顯著下降，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 hisA－Runx 2組表達水平顯著上升。兩組比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(圖4)。

圖1 RT－PCR擴增及酶切鑒定電泳結(jié)果

圖 2 Runx 2、amelotin、ameloblastin、ODAM在體外成釉細胞的表達

圖3 5d齡小鼠切牙牙胚免疫組化結(jié)果

圖4 Real－time PCR檢測Runx 2及AMBN，AMTN，ODAM mRNA表達變化

3 討論

近年來，關(guān)于調(diào)控牙齒發(fā)育的分子機制方面的研究已經(jīng)取得了很大的進步。在確立的與牙齒發(fā)育有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子中，Runx 2/cbfal是備受關(guān)注的一種。Runx 2是Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子家族成員，研究發(fā)現(xiàn)Runx 2作為成骨細胞分化的早期轉(zhuǎn)錄以及成熟的成骨細胞中基因表達的調(diào)控因子，在成骨過程中發(fā)揮著重要作用［8］。還有研究發(fā)現(xiàn)，Runx 2基因敲除小鼠中出現(xiàn)了牙齒器官發(fā)育不良的現(xiàn)象，這些牙齒器官缺乏明顯的成牙本質(zhì)細胞和成釉細胞的分化，無正常的牙本質(zhì)和釉質(zhì)基質(zhì)［1］。國內(nèi)外學者進行免疫組化和原位雜交實驗結(jié)果表明，在鼠的牙胚中包括牙上皮細胞、牙濾泡細胞、成骨細胞、成釉細胞和成牙本質(zhì)細胞等，均有過CbfaI的mRNA和蛋白的表達，而且表達有時空特異性［3，9］，這都提示 Runx 2 參與了牙胚的發(fā)育，它可能與細胞的分化和硬組織的形成有關(guān)。D'Souza等通過RT－PCR、原位雜交和基因敲除等試驗揭示:在牙齒發(fā)育過程中，Runx 2通過調(diào)控上皮與間充質(zhì)的相互作用來控制牙齒形態(tài)的發(fā)生和成釉器的組織分化［1］。AMTN和AMBN為成釉細胞分泌的牙釉質(zhì)基質(zhì)蛋白，其基因定位于人4號染色體q臂［10］，而常染色體遺傳性牙釉質(zhì)發(fā)育不全(Amelogenesis Imperfects，AI)也定位于此［11］。目前已有研究表明這兩種蛋白與牙釉質(zhì)發(fā)育和礦化都有關(guān)系，其成分、結(jié)構(gòu)和功能的改變與牙釉質(zhì)發(fā)育不全的發(fā)生密切相關(guān)［11］。ODAM是成釉細胞于成熟期高表達的細胞外基質(zhì)蛋白，該蛋白表達起始于成釉細胞的分泌階段，延伸至成釉細胞的成熟期［12－13］。相關(guān)的研究證實［12］:ODAM在大鼠切牙牙釉質(zhì)礦化和成熟過程中高表達，并且ODAM基因的過表達和缺失會引起基質(zhì)金屬蛋白20和釉叢蛋白表達的上升或下降，可引起小鼠牙齒的釉質(zhì)發(fā)育異常。

國內(nèi)外許多研究證實Runx 2可能與牙體硬組織的形成有關(guān)，然而，對于Runx 2對牙體硬組織形成的基因調(diào)控機制的研究卻甚少。本實驗構(gòu)建了Runx 2的真核表達載體，并設(shè)計針對Runx 2的特異性小分子干擾RNA(siRNA)。分別將其轉(zhuǎn)入小鼠成釉細胞中，通過RT－PCR檢測Runx 2、AMTN、AMBN及ODAM mRNA的表達變化。結(jié)果顯示，當Runx 2表達上調(diào)時，AMTN和AMBN mRNA的表達也上調(diào)，實驗組與對照組的表達差異有統(tǒng)計學意義，但實驗組與對照組ODAM mRNA的表達差異無統(tǒng)計學意義。當轉(zhuǎn)染Runx 2－siRNA后，Runx 2沉默效果明顯，實時定量PCR檢測到AMTN和AMBN mRNA表達下調(diào)，實驗組與對照組的差別有顯著統(tǒng)計學意義，實驗組與對照組ODAM mRNA的表達差異無統(tǒng)計學意義。本研究初步證實Runx 2通過調(diào)控AMTN及AMBN mRNA的表達參與牙體硬組織的發(fā)育，這為進一步研究Runx 2在牙釉質(zhì)形成中的作用奠定了基礎(chǔ)，對于牙釉質(zhì)疾病的預(yù)防及治療有潛在的指導作用。

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Effect of Runx 2 indevelopingdental enamel

HE Yong－yun，LIANGguang－zhi，LIU Xiao－ying，SUN Yan，GAO Yu－guang
(Institute of Stomotalogy，School of Stomotalogy，Weifang Medical University，Weifang 261053，China)

AIM:To investigate the regulating effects of Runx 2 on the expression of Amelotin(AMTN)，Ameloblastin(AMBN)and odontogenic ameloblast－asssociated protein(ODAM)in ameloblasts.METHODS:A full length cDNA of Runx 2 was cloned from mouse ameloblast－lineage cell(ALC)by RT－PCR，and then it was subcloned into the pcDNA3.1－HisA plasmid after sequence analysis.One specificdicer siRNA targeted to Runx 2 mRNA wasdesigned and sythesized.The recombinant plasmid pcDNA3.1－HisA－Runx2 and the siRNA for Runx2 mRNA was transfected into ALC respectively.Quantitative real－time PCR was performed to measure the expression of Runx 2，AMTN，AMBN and ODAMgene.RESULTS:The siRNA－Runx2 elicited a high level ofgene silence in ALC.siRNA for Runx 2 effectively inhibited the expression of AMTN and AMBN.Runx2 overexpression by pcDNA3.1－HisA－Runx 2 plasmid transfection resulted in a significant higher mRNA level of AMTN and AMBN，but exerted no significant effect on the expression of ODAM.CONCLUSION:Runx 2 may play an important role indevelopingdental enamel by regulating the expression of AMTN and AMBN.

Runx 2;amelotin;ameloblastin;odontogenic ameloblast－asssociated protein，ODAM;RT－PCR

R780.2

A

1005－2593(2011)02－0062－05

2010－10－08;

2010－12－16

國家自然科學基金資助項目(36072316)

山東省自然科學基金資助項目(Y2006C106)

山東省教育廳基金資助項目(J08LH65)

何永云(1984－)，女，漢族，山東省日照人。碩士生(導師:高玉光)，研究方向:牙釉質(zhì)發(fā)育

高玉光，E －mail:yuguanggao@wfmc.edu.cn

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