李 明，潘曉潔，陳小娟，萬成炎

（水利部中國科學(xué)院水工程生態(tài)研究所，湖北武漢430079）

目前，我國水體不僅面臨由營養(yǎng)過度引起的水環(huán)境富營養(yǎng)化和水華，而且還面臨水環(huán)境復(fù)合毒物污染的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，近幾年來在飲用水水源中檢出有毒有機(jī)污染物屢見不鮮［1］。為盡早遏制我國水環(huán)境中的復(fù)合毒物污染，強(qiáng)化水環(huán)境監(jiān)測不僅要體現(xiàn)在理化監(jiān)測的層面上，還應(yīng)汲取發(fā)達(dá)國家的經(jīng)驗，提倡在線生物毒性監(jiān)測技術(shù)在復(fù)合毒物污染源監(jiān)控和水資源管理中的應(yīng)用，使理化監(jiān)測和生物檢測技術(shù)相結(jié)合，優(yōu)勢互補(bǔ)，提高我國水環(huán)境的毒物污染控制和水環(huán)境風(fēng)險管理水平。

作為在線生物監(jiān)測的一種有效手段，越來越多的在線生物毒性監(jiān)測儀被應(yīng)用，如在線熒光監(jiān)測系統(tǒng)、在線攝像系統(tǒng)、蘭腮太陽魚監(jiān)測系統(tǒng)以及多物種淡水生物監(jiān)測儀等在線生物監(jiān)測設(shè)備已經(jīng)在多個國家應(yīng)用于水體突發(fā)性污染事故的在線預(yù)警［2－5］。雖然傳統(tǒng)的物理化學(xué)監(jiān)測技術(shù)精確度高，并能準(zhǔn)確地測定出水體中物質(zhì)的濃度，但是它卻不能反映水體中污染物的毒性和評價生物風(fēng)險。在線生物毒性監(jiān)測儀與之相比有著其自身特點及優(yōu)勢：①能夠監(jiān)測污染物毒性。物理化學(xué)監(jiān)測技術(shù)只能檢測數(shù)量有限的污染物的種類和濃度，無法反映污染物的毒性及對其生物風(fēng)險進(jìn)行評價，且不能確定不同的有毒物質(zhì)之間的相互作用。②具備實時在線監(jiān)測的功能。物理化學(xué)監(jiān)測技術(shù)往往需要定點定時進(jìn)行采樣分析，難以做到實時在線監(jiān)測及預(yù)先報警的功效 。③操作簡單、成本較低［6－7］。

bbe藻毒性儀由德國bbe公司（bbe Moldaenke GmbH）生產(chǎn)，多用于環(huán)境監(jiān)測站和水務(wù)公司，已在歐洲各地得到廣泛應(yīng)用［8－9］。該儀器基于葉綠素?zé)晒庠?，利用藻類對水體毒性進(jìn)行在線監(jiān)測，對除草劑和它們的降解產(chǎn)物尤其敏感，能檢測到低至0.5ug／L的除草劑阿特拉津；該儀器在運(yùn)行中無需進(jìn)行測試生物的管理，測試生物更換周期可達(dá)7d，具有自動清洗檢測單元，斷電后再通電時，系統(tǒng)也可自動恢復(fù)；此外，該儀器還具有自動取樣裝置，可以連續(xù)24h在線監(jiān)測，并可通過網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行遠(yuǎn)程控制（實時雙方向的監(jiān)控），基于數(shù)據(jù)庫的軟件可以隨時保存數(shù)據(jù)和參數(shù)。

盡管bbe藻毒性儀在水體毒性在線監(jiān)測中具有如此多的的優(yōu)勢，但由于種種原因，我國卻仍未有此儀器的應(yīng)用。因此本文擬對其進(jìn)行較為詳細(xì)的介紹，希望能為提高我國水體在線監(jiān)測的技術(shù)水平提供借鑒和參考。

1 原理及構(gòu)造

檢測原理是基于測定藻類的熒光光譜和動力學(xué)，此方法的優(yōu)點是能對藻類的狀態(tài)快速做出反應(yīng)（30min），而傳統(tǒng)的藻類急性生長抑制實驗卻要持續(xù)72h。在bbe藻毒性儀中，測試藻在一個有光照且恒溫的容器中連續(xù)生長，每次檢測時，自動抽取一定量藻液與樣品水混合，通過檢測不同光照強(qiáng)度下的熒光反應(yīng)，可確定光合作用的強(qiáng)度。因為藻類的光合作用對外界脅迫的反應(yīng)很敏感，因此可通過監(jiān)測光合作用來反映水樣毒性。

此外，因為水樣中本身可能也含有多種藻類，如產(chǎn)藻毒素的藍(lán)藻和產(chǎn)異味的硅藻等，因此為了檢測水樣中不同種類藻的活性，藻毒性儀中的葉綠素檢測器也同時檢測出不同藻中的色素。

Bbe藻毒性儀主要由藻培養(yǎng)罐、葉綠素檢測器、電腦部分和管路系統(tǒng)4部分構(gòu)成（圖1，圖2）。

1.1 藻培養(yǎng)罐

如圖1所示，儀器中間綠色部分就是藻培養(yǎng)罐，由一個2L的玻璃圓柱體和不銹鋼頂盤和底盤組成，頂部的不銹鋼盤通過4根鋼管與底盤固定起來，兩個盤內(nèi)部都有密封圈。底盤下部有一個鋁制的底座通過珀耳帖效應(yīng)散熱調(diào)節(jié)溫度，新鮮的營養(yǎng)液和空氣分別通過頂蓋上相鄰的兩個孔加入，多余的藻液從另一個孔排出，還有一個孔用于每次取少量藻

圖1 bbe藻毒性儀外形圖

圖2 bbe藻毒性儀結(jié)構(gòu)模式圖

液檢測。在培養(yǎng)罐中央是一根不銹鋼包裹的鉑金溫度計。曝氣管通到培養(yǎng)罐底部，通過曝氣使培養(yǎng)罐內(nèi)藻液混合均勻。氣流也使培養(yǎng)罐中幾十個黑色的小PVC顆粒上下浮動，防止培養(yǎng)罐內(nèi)形成生物膜和沉積物。

檢測開始時加入一定量藻培養(yǎng)液到培養(yǎng)罐中，然后在自動的光照、營養(yǎng)和溫度條件下培養(yǎng)藻。為使藻的生理狀態(tài)保持穩(wěn)定，每個檢測周期都會檢測培養(yǎng)罐中藻的濃度和活性，根據(jù)設(shè)定的目標(biāo)值自動調(diào)整加入的營養(yǎng)液的量，使得藻的濃度和活性保持相對穩(wěn)定（圖2）。

1.2 葉綠素檢測器

圖1中藻培養(yǎng)罐右邊的銀色圓柱體就是葉綠素檢測器，是一個完全封閉的、獨(dú)立的亞單元，作用是對葉綠素?zé)晒膺M(jìn)行檢測，包括檢測電路、激發(fā)光、各種光學(xué)元件和一個能記錄數(shù)據(jù)的微型控制器。葉綠素檢測器由電源供電，并將得到的數(shù)據(jù)通過底部的防水電線傳送至電腦。由清潔活塞通過上下活動來清潔石英槽，清潔過程由程序預(yù)先設(shè)定，在每次檢測過程結(jié)束后自動進(jìn)行。

當(dāng)檢測器內(nèi)部的測量槽變臟時就需要拆洗，先拆下檢測器上連接的電線和水管，去掉螺絲后翻轉(zhuǎn)過來，垂直打開蓋板，用軟毛巾清潔檢測器內(nèi)部、蓋子和密封圈等。

1.3 電腦部分

圖1中位于藻培養(yǎng)罐和葉綠素檢測器上部的就是電腦部分，包括顯示器、鍵盤、鼠標(biāo)和磁盤驅(qū)動器等，電腦中有專門的軟件（ATox）控制整個儀器并負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)被記錄在內(nèi)部的硬盤上，可被轉(zhuǎn)移到軟盤上或通過網(wǎng)絡(luò)傳送到其他電腦上以進(jìn)一步分析。

1.4 管路系統(tǒng)

藻毒性儀的管路系統(tǒng)包括一系列規(guī)格、成分不同的軟管、蠕動泵和閥，在電腦部分的控制下泵入或泵出樣品水、參比水和參比毒性物等（圖2）。蠕動泵泵入的液體量是由泵轉(zhuǎn)動次數(shù)和軟管的內(nèi)徑?jīng)Q定的，bbe藻毒性儀上有兩種泵：樣品／藻液泵和營養(yǎng)液泵。在樣品／藻液泵里使用的是比較耐磨的marprene管，在營養(yǎng)液泵里使用含有鉑金的硅膠管。

2 應(yīng)用軟件

Bbe藻毒性儀配有專門的軟件ATox，可在任何一臺計算機(jī)上安裝使用（圖3）。

這是一款基于圖形界面開發(fā)的軟件，使用非常方便。該軟件界面主要包括4個部分，1）用于控制儀器運(yùn)行的菜單和工具欄；2）用于顯示監(jiān)測結(jié)果的圖；3）顯示儀器運(yùn)行狀態(tài)的狀態(tài)欄；4）警報欄，顯示警報信息。

2.1 菜單和工具欄

圖3 bbe藻毒性儀的軟件界面

菜單和工具欄位于屏幕的上方。菜單中的“File”選項卡主要用于文件操作或打印圖片等；“Measurement”用于控制儀器的運(yùn)行或停止，設(shè)置警報參數(shù)和藻培養(yǎng)罐的調(diào)節(jié)；“View”選項卡主要用于控制屏幕上圖形的顯示方式，部分功能可通過工具欄上的按鈕完成；“Window”用于控制屏幕上窗口的類型和數(shù)量；“Parameter”選項卡用于設(shè)置所有與監(jiān)測過程相關(guān)的重要參數(shù)，但在儀器運(yùn)行監(jiān)測的過程中無法修改參數(shù)；“Test”選項卡用于對藻毒性儀的各個部件進(jìn)行單獨(dú)測試，對儀器進(jìn)行診斷和糾錯；“Calibration”選項卡用于校正葉綠素檢測器、藻培養(yǎng)罐的溫度控制器、泵的運(yùn)行速率等；最后一個是“Help”選項卡為用戶操作提供幫助。工具欄的快捷按鈕主要用于對監(jiān)測圖進(jìn)行一些快速操作，如前后移動，放大縮小等。

2.2 監(jiān)測圖

占據(jù)屏幕左下方大部分位置的就是監(jiān)測圖，以圖形的方式直觀地向用戶顯示主要數(shù)據(jù)的監(jiān)測結(jié)果。每一幅小圖顯示一種監(jiān)測數(shù)據(jù)，幾幅小圖可同步顯示多種監(jiān)測數(shù)據(jù)。其中通常顯示的幾個重要數(shù)據(jù)分別是：抑制率、溫度、藻活性和葉綠素濃度。

2.3 狀態(tài)欄

狀態(tài)欄顯示儀器運(yùn)行狀態(tài)及警報信息。當(dāng)選擇“Alarm”選項卡時，紅色或綠色的圓片表示是否有警報信息，紅色表示警報，綠色表示沒有警報，一切正常。圓片下方顯示最重要的監(jiān)測值－抑制率（inhibition），以及其它一些警報評估結(jié)果。

“Process State”選項卡顯示儀器的運(yùn)行及調(diào)控狀態(tài)。一共有3條“Progress bar”，第一條表示藻培養(yǎng)罐中藻濃度的調(diào)節(jié)狀態(tài)，第二條表示藻培養(yǎng)罐中溫度的調(diào)節(jié)狀態(tài)，最下方的一條顯示儀器的監(jiān)測運(yùn)行狀態(tài)。

2.4 警報欄

警報欄是位于監(jiān)測圖上方的一條細(xì)線，綠色表示監(jiān)測結(jié)果正常，紅色表示有警報信息，灰色表示這段時間儀器停止運(yùn)行。

3 主要功能

該儀器能對樣品水中的毒性物質(zhì)和藻的種類、活性等進(jìn)行檢測。

3.1 藻活性的檢測

藻類利用光能進(jìn)行光合作用，如果沒有額外的背景光，就大量利用照射光，因此就不發(fā)射熒光，如果有強(qiáng)烈的背景光，光照激發(fā)的熒光也相應(yīng)增強(qiáng)。若藻細(xì)胞已死亡，光照就不能被藻細(xì)胞所利用，因此即使沒有額外的背景光，熒光反應(yīng)也較強(qiáng)。因此藻活性的檢測包括在2種不同條件下對弱光的熒光反應(yīng)，一次檢測以強(qiáng)光作為背景光，另一次則沒有背景光。用參數(shù)“Genty”反映藻活性，公式如下：

Genty：以百分?jǐn)?shù)的形式表示藻活性，其數(shù)值取決于藻的種類和生理狀態(tài)，最高可達(dá)到75%，至少應(yīng)高于60%；

Fo：沒有背景光時熒光反應(yīng)；Fm：有強(qiáng)背景光時熒光反應(yīng)。

3.2 檢測樣品水中毒性物質(zhì)

在上述藻活性檢測的基礎(chǔ)上，通過檢測樣品水中不同類群藻的含量及活性來檢測水中的毒性物質(zhì)。首先，培養(yǎng)罐中的藻液被加入到樣品水中，通過上述的公式檢測得到混合液中藻的含量和活性，即樣品水活性值［Genty（sample）］，然后檢測藻液與清水混合后的活性，得到參照活性值［Genty（reference）］。將上述兩個活性值比較，可得樣品水對藻活性的抑制率（inhibition）：

通過參照活性值還可調(diào)整加入培養(yǎng)罐的營養(yǎng)液的量，使培養(yǎng)罐中藻的數(shù)量和生理狀態(tài)保持相對穩(wěn)定。

3.3 檢測藻的不同類群

不同類群的藻含有的色素不同，通過熒光反應(yīng)激發(fā)的光的顏色也不同，每個類群的藻都有獨(dú)特的“指紋”（fingerprint）用于區(qū)分這些藻類，可檢測并記錄樣品水中混合藻的光譜，再通過計算即可得樣品水中不同藻的含量。

4 調(diào)試效果

為了檢驗bbe藻毒性儀的監(jiān)測效果，以蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）作為測試藻種，采用等倍數(shù)方法配置不同濃度的Cu2＋和Cd2＋溶液，反應(yīng)間隔分別設(shè)置為30min、1h、2h，每次監(jiān)測時間相應(yīng)分別設(shè)置為3h、6h、和12h。以下是得到的實驗結(jié)果：

圖4 不同濃度和反應(yīng)間隔下Cu2＋對蛋白核小球藻的抑制率

由圖中可知，隨著反應(yīng)間隔的延長，Cu2＋對蛋白核小球藻的抑制率也逐漸增大；除了濃度6.4mg／l外，隨著濃度的增加，Cu2＋對小球藻的抑制率也是逐漸增大，但對于6.4mg／L的濃度來說，反而比3.2mg／L時的抑制率更低，具體原因還有待進(jìn)一步研究和分析。根據(jù)以上的實驗結(jié)果，用回歸法可預(yù)測得出不同反應(yīng)間隔和抑制率響應(yīng)下的Cu2＋濃度，具體結(jié)果見表1。

表1 不同反應(yīng)間隔和抑制率響應(yīng)下的Cu2＋濃度mg·L－1

由圖中可知，隨著反應(yīng)間隔的延長和濃度的增加，Cd2＋對蛋白核小球藻的抑制率也是逐漸增大的，根據(jù)以上的實驗結(jié)果，用回歸法可預(yù)測得出不同反應(yīng)間隔和抑制率響應(yīng)下的Cd2＋濃度，具體結(jié)果見表2：

圖5 不同濃度和反應(yīng)間隔下Cd2＋對蛋白核小球藻的抑制率

表2 不同反應(yīng)間隔和抑制率響應(yīng)下的Cd2＋濃度mg·L－1

由此可知，bbe藻毒性儀能監(jiān)測到較低濃度的重金屬Cu2＋和Cd2＋離子，且在較短的反應(yīng)間隔（30～60min）下就有比較明顯的反應(yīng)，適用于對水體重金屬污染進(jìn)行在線監(jiān)測。

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