羅曉娟，姜 鵬，侯明明，李 川

（重慶工商大學(xué)廢油資源化技術(shù)與裝備教育部工程研究中心，重慶400067）

石油是由不同的碳?xì)浠衔锘旌辖M成的，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，石油的使用越來越廣泛，由油液產(chǎn)生的環(huán)境的污染日益嚴(yán)重。因此減少油液對(duì)環(huán)境的污染是十分必要的。油液污染的處理方法有機(jī)械法、化學(xué)法、物理化學(xué)法和生物法［1］。而采用生物法減少油液對(duì)環(huán)境的污染因?yàn)槠鋬?yōu)越性，已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。生物法是指利用生物體催化降解有機(jī)污染物，轉(zhuǎn)化為其他污染物從而消除污染的一個(gè)受控或自發(fā)進(jìn)行的過程［2］。生物法具有生產(chǎn)費(fèi)用低，不產(chǎn)生二次污染，能在原位進(jìn)行修復(fù)等優(yōu)點(diǎn)，是一項(xiàng)具有發(fā)展前景的新技術(shù)［3］。本實(shí)驗(yàn)以柴油為代表性油液污染物，從含油廢水中篩選出一株能以柴油為唯一碳源并生長良好的除油菌，并對(duì)其降解條件進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）菌種來源

從含油廢水中分離、篩選、馴化而得。

（2）培養(yǎng)基

液體營養(yǎng)培養(yǎng)基：葡萄糖10.0g／L，蛋白胨6.0g／L，酵母粉2.0g／L，pH 7.0。

固體營養(yǎng)培養(yǎng)基：葡萄糖10.0g／L，蛋白胨6.0g／L，酵母粉2.0g／L，瓊脂15.0g／L，pH 7.0。

石油培養(yǎng)基：柴油10g／L，硝酸胺2.0／L，磷酸二氫鉀2.0／L，微量元素液：4.0ml／L，pH 7.0。

微量元素液：硫酸鎂2.0g，硫酸銅0.5g，高硫酸錳0.5g，硫酸鐵0.5g，氯化鈣0.5g，水500mL。

1.2 方法

（1）除油菌的篩選及馴化

將10mL含油廢水加入到裝有90mL無菌水的三角瓶中，30℃，200r／min，振蕩30min。對(duì)振蕩均勻的樣品稀釋106，107，108倍，取0.1mL稀釋液到柴油培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋濃度重復(fù)3次，30℃，恒溫培養(yǎng)4～5d。把生長較好的菌落菌株在營養(yǎng)培養(yǎng)基平板上劃線并進(jìn)行連續(xù)劃線培養(yǎng)，經(jīng)過多次劃線純化后，直至分離純化得到單個(gè)菌株。純化后的菌種在柴油培養(yǎng)基平板上劃線馴化3～4次，獲得柴油降解菌種。將篩選到的柴油降解菌種進(jìn)行試管斜面培養(yǎng)，并在4℃低溫保存。

（2）柴油標(biāo)準(zhǔn)曲線

取0.052g柴油于25mL容量瓶中，用石油醚定容至標(biāo)線。取5mL該溶液于50mL容量瓶中，用石油醚定容至標(biāo)線。分別取2，3，4，5，6，7，8，10 mL于比色管中，定容至10mL。采用紫外分光光度法［4］于264nm處測定其吸光度，繪制標(biāo)線曲線，如圖1。其線性回歸方程為：Y＝0.3466X＋0.0008，R2＝0.9948。

圖1 柴油標(biāo)準(zhǔn)曲線

（4）影響除油菌降解率因素實(shí)驗(yàn)方法

將除油菌接種于營養(yǎng)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48h，按5%的接種量接種于柴油培養(yǎng)基中，初始pH值為7.0，初始含油量為10g／L，恒溫30℃振蕩培養(yǎng)。分別進(jìn)行以下幾組實(shí)驗(yàn)，以確定除油菌降解柴油的最佳生長條件。a）將溫度分別設(shè)定為20，25，30，

（3）除油菌降解率的測定

將馴化后的除油菌接種至柴油培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)7天后，用紫外分光光度計(jì)測定其吸光度，計(jì)算出剩余含油量。降解率計(jì)算公式：35，40℃（pH值為初始值，培養(yǎng)基為見1.1節(jié)），培養(yǎng)7d后測定其降解率。b）將pH值分別設(shè)定為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0（溫度為室溫，培養(yǎng)基為見1.1節(jié)），培養(yǎng)7d后測定其降解率。c）將柴油培養(yǎng)基分別配置成氯化銨濃度為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 g／L的溶液（溫度為室溫，pH值為初始值），培養(yǎng)7 d后測定其降解率。d）將培養(yǎng)菌的溫度、pH值、氯化銨的濃度都設(shè)定為前面3組實(shí)驗(yàn)所取得的最佳條件，培養(yǎng)7d后測定其降解率。

2 結(jié)果與討論

2.1 除油菌的篩選

經(jīng)過平板劃線分離培養(yǎng)，篩選馴化出對(duì)含油廢水具有降解效果的除油菌，其中一株菌種在高含柴油培養(yǎng)基中生長較好，選定為研究菌種。其在10g／L的柴油培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3d后的降解率為37%。

2.2 除油菌降解率研究

（1）溫度對(duì)降解率的影響

溫度是微生物的重要生存因素［5］。微生物能生長的溫度范圍較廣，一般在－10℃～95℃都可以生長，但每一種微生物都有其最佳的生長溫度［6］。當(dāng)溫度較低時(shí)，首先微生物生長緩慢，其次微生物的分解活動(dòng)需要酶的參與，溫度低時(shí)，影響酶的活性；當(dāng)溫度較高時(shí)，微生物過度生長并使微生物的酶發(fā)生變性，從而影響降解率。在微生物生長的最佳溫度范圍內(nèi)，微生物的新陳代謝旺盛，對(duì)含油廢水的處理也較好。同時(shí)，溫度也影響石油烴類的物理性質(zhì)和化學(xué)組成［7］。從圖2可以看出，除油菌的降解率是隨著溫度的升高而升高的，當(dāng)溫度升高到30℃的時(shí)候，降解率是最高的，此后降解率隨著溫度的升高而降低，所以該除油菌的最佳生長溫度為30℃。

圖2 溫度對(duì)降解率的影響

（2）pH值對(duì)降解率的影響

微生物的生命活動(dòng)、物質(zhì)代謝與pH值密切相關(guān)。微生物的細(xì)胞膜電荷會(huì)隨著pH值的變化而變化，這就影響了微生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用和其在代謝過程中酶的活性。這是因?yàn)殡S著pH值的變化，酶分子上的酸性及堿性氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)處于不同的解離狀態(tài)。具有催化活性的基團(tuán)在總酶量中的比例不同使得酶分子的催化能力也不一樣［8］。從圖3可以看出，該除油菌在pH值為7.0時(shí)，降解率達(dá)到了最大值，說明該菌適合在接近中性的環(huán)境中生長。

圖3 pH值對(duì)降解率的影響

（3）氮源濃度對(duì)降解率的影響

氮源是作為合成細(xì)胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物中含氮物質(zhì)的原料，一般不用做能源物質(zhì)。氮素不足常常會(huì)限制生物體的生長繁殖，因此應(yīng)在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)和適量的氮源以滿足生物體的需要［9］。從圖4可以看出氮源濃度為1.5g／L時(shí)，降解率最大。這是因?yàn)榈床蛔銓?duì)菌體生長繁殖及降解功能影響較大。但氮源過量對(duì)菌株有一定的抑制作用［10］。

圖4 氮源濃度對(duì)降解率的影響

（4）優(yōu)化條件下的降解率

通過前述實(shí)驗(yàn)，得到該除油菌的優(yōu)化條件為溫度30℃，pH7.0，氯化銨濃度1.5g／L。在此條件下振蕩培養(yǎng)7d，除油菌的降解率為56%。

3 結(jié) 論

（1）通過對(duì)含油廢水中的微生物進(jìn)行篩選馴化可以得到以柴油廢水為唯一碳源的除油菌，本實(shí)驗(yàn)通過篩選馴化的除油菌可以在以柴油為唯一碳源的柴油培養(yǎng)基中生長，對(duì)高濃度的含柴油廢水有一定降解能力。

（2）從含油廢水中篩選出一株除油菌，經(jīng)馴化后，對(duì)柴油具有一定的降解率，在柴油濃度為10g／L的培養(yǎng)基中，降解率為56%。

（3）從實(shí)驗(yàn)中得出，該除油菌的最優(yōu)條件為：溫度30℃，pH7.0，氯化銨濃度1.5g／L。

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