張 萌，費(fèi)洪新，丁晨羲，韓婷婷

齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，黑龍江齊齊哈爾 161000

紫杉醇（paclitaxel，PA）是重要的抗腫瘤藥物，對(duì)晚期乳腺癌、鼻咽癌、肺癌、淋巴瘤等均有一定療效，為周期特異性的藥物，被認(rèn)為是一種廣譜抗癌藥物。PA是最好的天然抗癌藥物之一，其藥理作用獨(dú)特。PA是四環(huán)二萜類生物堿，分子式為C47H51O14N，具有高度親脂性，不溶于水，但能溶于甲醇、乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑，血漿蛋白結(jié)合率為95%等特性[1-2]。在體外建立多藥耐藥細(xì)胞系是研究腫瘤產(chǎn)生多藥耐藥性的重要方法。目前國(guó)內(nèi)外尚缺乏人胃癌MGC803/PA的理想的細(xì)胞模型，實(shí)驗(yàn)采用逐漸增加藥物PA濃度，建成人胃癌MGC803/PA耐藥細(xì)胞系，研究耐藥過(guò)程中細(xì)胞株的變化，建立理想的耐藥細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

MTT上海華舜生物工程有限公司；紫杉醇（PA）Gibcoq/BRL公司（USA）提供；長(zhǎng)春新堿（VCR）上海華聯(lián)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；5-氟尿嘧啶（5-FU）上海旭東海普藥業(yè)有限公司；絲裂霉素（MMC）；阿霉素（ADM ）澳大利亞F.H.Faulding公司生產(chǎn)；RPMI-1640由F.H.Faulding公司提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人MGC803為人胃癌細(xì)胞系，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)黃小義博士提供。購(gòu)買人胃癌MGC803細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)在經(jīng)過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在無(wú)菌溫箱進(jìn)行培養(yǎng)，用PBS配制的0.15%的胰蛋白酶消化細(xì)胞傳代，每周傳代2次，收集生長(zhǎng)旺盛的腫瘤MGC803細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.3 耐藥細(xì)胞系的建立

選取生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞MGC803細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)液中，從0.05 μg/ml作用濃度開始，2 d后棄去培養(yǎng)液，加入新鮮的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)MGC803細(xì)胞，MGC803細(xì)胞恢復(fù)正常生長(zhǎng)在消化傳代MGC803細(xì)胞后繼續(xù)用0.05 μg/ml的藥物濃度處理MGC803細(xì)胞2 d，繼續(xù)反復(fù)換液處理、傳代逐步提高PA濃度誘導(dǎo)MGC803細(xì)胞，最后獲得一株能耐受0.5 μg/ml的MGC803細(xì)胞株，擬命名為MGC803/PA，并且將MGC803培養(yǎng)在含有0.1 μg/ml的完全培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，還要經(jīng)常凍存細(xì)胞，觀察細(xì)胞凍存后的復(fù)蘇狀況。

1.4 MGC803細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制結(jié)果

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC803細(xì)胞，接種于培養(yǎng)板中，每孔200 μl，一種細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每天取一塊培養(yǎng)板，棄培養(yǎng)液，加入無(wú)血清培養(yǎng)液180 μl，每孔加入MTT（5 g/L）20 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，終止培養(yǎng)，棄培養(yǎng)液，加入 DMSO液體150 μl，振蕩，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm光吸收值，以空白Control孔調(diào)零，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞抑制率為縱坐標(biāo)，分別測(cè)定不同濃度的PA對(duì)MGC803細(xì)胞分別在不同時(shí)間的生長(zhǎng)抑制率，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線。

1.5 MTT法測(cè)定藥物的毒副作用

選用培養(yǎng)板內(nèi)加入MGC803細(xì)胞混合液，每孔加入200 μl，加入倍比稀釋成5種濃度的各種抗癌藥物20 μl，對(duì)照組加入等體積的生理鹽水，設(shè)立空白對(duì)照組，放置于孵箱中培養(yǎng)68 h后棄液，每孔中加入不完全培養(yǎng)液180 μl及其5 g/L的MTT 25 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后小心棄液，每孔 DMSO 150 μl，置于微量振蕩器上振蕩5 min，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm光吸收值，以空白Contro1孔調(diào)零。計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率和耐藥指數(shù)。

1.6 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

1.6.1 光學(xué)顯微鏡觀察 將MGC803細(xì)胞混合液接種于培養(yǎng)板，置于孵箱內(nèi)培養(yǎng)3 d后用PBS洗滌3次，HE及其瑞氏染液染色15 min，再用PBS洗滌2次，常溫干燥，鏡下觀察。1.6.2電子顯微鏡觀察 選用MGC803細(xì)胞消化后的混合液，收集細(xì)胞，用戊二醛固定，四氧化鋨固定，脫水、包埋、切片和染色，按常規(guī)處理，透射電鏡鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)MGC803細(xì)胞

MGC803/PA細(xì)胞對(duì)PA的2、3、4個(gè)月耐藥指數(shù)分別是5.12、11.46、15.98，并且對(duì)另外幾種抗癌藥物也有一定程度的耐藥現(xiàn)象（表1～4）。觀察半數(shù)抑制濃度（IC50）的改變，細(xì)胞耐藥指數(shù)（RI）的改變。

表1 對(duì)照組MGC803藥物敏感性的觀察

表2 MGC803細(xì)胞藥物處理2個(gè)月藥物敏感性的觀察

表3 MGC803細(xì)胞藥物處理3個(gè)月藥物敏感性的觀察

表4 MGC803細(xì)胞藥物處理4個(gè)月藥物敏感性的觀察

2.2 細(xì)胞光鏡及電鏡下觀察

2.2.1 細(xì)胞光鏡下觀察 MGC803細(xì)胞與MGC803/PA細(xì)胞均呈均勻排列，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，多邊形；MGC803細(xì)胞邊界清楚，細(xì)胞核較大，核仁明顯，細(xì)胞核有凹陷。MGC803/PA細(xì)胞隨著PA藥物劑量的增加，藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，處理4個(gè)月時(shí)出現(xiàn)MGC803/PA細(xì)胞的細(xì)胞邊界不清楚，細(xì)胞體積略微增大，細(xì)胞核不規(guī)則，有時(shí)出現(xiàn)較大的凹陷或者巨細(xì)胞，見圖1。

2.2.2 細(xì)胞電子顯微鏡觀察 紫杉醇加入藥物2個(gè)月后MGC803與MGC803/PA線粒體數(shù)目沒(méi)有差別，紫杉醇加入3個(gè)月后MGC803與MGC803/PA糖原減少，紫杉醇加入藥物4個(gè)月后MGC803與MGC803/PA線粒體數(shù)目減少，可見到假性包涵體（圖2）。

2.3 細(xì)胞生長(zhǎng)和群體倍增時(shí)間

人腫瘤胃癌MGC803細(xì)胞株與MGC803/PA細(xì)胞株的生長(zhǎng)周期不同，群體倍增時(shí)間分別為2個(gè)月為34.70、41.31 h；3個(gè)月為 26.42、51.23 h；4 個(gè)月為 27.34、55.92 h；耐藥細(xì)胞較親代細(xì)胞在相同的時(shí)間條件下分別延長(zhǎng)了6.61、24.81、28.58 h，可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的群體倍增時(shí)間是逐漸延長(zhǎng)的（圖3）。

3 討論

目前國(guó)內(nèi)外建立腫瘤耐藥細(xì)胞系的方法通常是藥物濃度遞增持續(xù)法和大劑量間歇誘導(dǎo)法。腫瘤多藥耐藥產(chǎn)生是與腫瘤細(xì)胞表面過(guò)剩表達(dá)一種P-糖蛋白有關(guān)，分子量為1.7×105。P-糖蛋白具有將抗腫瘤的藥物泵出細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度降低，從而減少藥物對(duì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的損傷，同時(shí)研究表明多藥耐藥基因相關(guān)蛋白與腫瘤多藥耐藥也密切相關(guān)[3-5]。引起耐藥機(jī)制可能是P-糖蛋白和藥耐藥基因相關(guān)蛋白的作用底物不同所造成。

應(yīng)用逐漸增加抗腫瘤藥物PA的濃度，誘導(dǎo)MGC803細(xì)胞耐藥，經(jīng)過(guò)4個(gè)月建成人胃癌MGC803耐藥細(xì)胞系，并且命名為MGC803/PA。光鏡下觀察MGC803/PA細(xì)胞與其MGC803細(xì)胞存在較大形態(tài)差異，MGC803/PA細(xì)胞邊界不清楚，細(xì)胞體積略微增大，細(xì)胞核不規(guī)則，有時(shí)出現(xiàn)較大的凹陷或者巨細(xì)胞。MGC803/PA巨細(xì)胞的出現(xiàn)提示細(xì)胞受到損傷、細(xì)胞分裂減少。在電子顯微鏡下觀察下，可以見到MGC803/PA細(xì)胞核大、細(xì)胞核畸形、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有假性包涵體、微絨毛較多，可見細(xì)胞核分裂的現(xiàn)象，這些均表明MGC803/PA細(xì)胞生長(zhǎng)代謝緩慢、分裂活動(dòng)減弱等。人胃癌MGC803/PA細(xì)胞通過(guò)研究細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定群體倍增時(shí)間發(fā)現(xiàn)2、3、4個(gè)月MGC803/PA細(xì)胞較MGC803細(xì)胞延長(zhǎng)的時(shí)間分別為6.61、24.81、28.58 h，提示人胃癌MGC803/PA細(xì)胞對(duì)化療的敏感性就下降，療效相對(duì)較差，治療上就必須加大藥物的劑量。

體外建立的耐藥細(xì)胞對(duì)PA的相對(duì)耐受度較親代細(xì)胞2、3、4 個(gè)月分別提高的指數(shù)是 5.12、11.46、15.98。 表明MGC803 細(xì)胞耐藥是逐漸形成的，一般是PA持續(xù)作用MGC803細(xì)胞3個(gè)月就可以把MGC803細(xì)胞耐藥了，同時(shí)使細(xì)胞總是處于一個(gè)較大的劑量的藥物環(huán)境中，同時(shí)還要經(jīng)常復(fù)蘇細(xì)胞，耐藥性能方可以穩(wěn)定下來(lái)。MGC803/PA細(xì)胞表現(xiàn)出較為穩(wěn)定的耐藥性，MGC803/PA細(xì)胞凍存后復(fù)蘇后狀態(tài)良好。MGC803/PA細(xì)胞系不僅對(duì)PA產(chǎn)生耐藥，而且對(duì)從未接觸的ADM等多種抗癌藥物也產(chǎn)生不同程度的耐藥性，說(shuō)明MGC803/PA細(xì)胞系耐藥性能相對(duì)穩(wěn)定，是篩選逆轉(zhuǎn)劑建立理想的耐藥細(xì)胞模型。

綜上所述，MGC803/PA細(xì)胞具有耐藥表型，且耐藥性能穩(wěn)定，MGC803/PA的增殖能力逐漸下降，MTT法及其電鏡可以較早地提示MGC803/PA的耐藥特征。實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、MTT、電子顯微鏡等檢測(cè)方法是逐漸改變MGC803細(xì)胞，MTT法和電子顯微鏡與其他的檢測(cè)相比較好，但成本較高。因此，建立MGC803耐藥細(xì)胞系的過(guò)程中，MTT法是首選的檢測(cè)方法，后續(xù)的工作中尚需要進(jìn)行流式細(xì)胞儀及其蛋白質(zhì)印記進(jìn)行檢測(cè)此耐藥細(xì)胞株的穩(wěn)定性。

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