徐冬香，游慶華，王愛(ài)華，葉惠英

1.上海市復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院南匯分院內(nèi)分泌科，上海 201300；2.上海市復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院南匯分院病理科 201300

在惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，細(xì)胞凋亡異常具有非常重要的作用，即腫瘤的發(fā)生發(fā)展中往往伴有抑凋亡基因的表達(dá)增強(qiáng)或促凋亡基因的受抑。Survivin和Smac是一組重要的且功能相互拮抗的凋亡調(diào)控蛋白。我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Survivin和Smac在甲狀腺腫瘤中的表達(dá)情況，并分析Survivin表達(dá)與臨床病理因素和Smac的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2000年1月～2009年2月在我院外科行手術(shù)治療的甲狀腺腫瘤患者80例，其中，男10例，女70例；年齡14～78歲，平均40歲；病程1 d～10年，平均3年。

1.2 方法

1.2.1 病理檢查 標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，按照WHO（2003）甲狀腺腫瘤診斷和分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)由兩位高年資病理醫(yī)師明確診斷并行病理組織分型。

1.2.2 檢測(cè)方法 采用Envision兩步法，兔抗人多克隆抗體Survivin，工作濃度1：150；兔抗人多克隆抗體Smac，工作濃度1∶200。脫蠟、水化組織切片；預(yù)處理組織切片；蒸餾水漂洗，置于PBS中10 min；一抗孵育10～30 min；PBS漂洗10 min；EnvisionTM 孵育 10～30 min；PBS漂洗 10 min；色源底物溶液孵育10 min；蒸餾水漂洗；蘇木素復(fù)染及封片。已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定

采用半定量積分方法[1]，以細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核出現(xiàn)淡黃至棕黃色為陽(yáng)性。高倍鏡下按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行結(jié)果判定，即高倍鏡下隨機(jī)觀察計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野（×200）。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和顯色強(qiáng)度分為4級(jí)，（－）：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%或無(wú)陽(yáng)性物質(zhì)的表達(dá)；（+）：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為 5%～25%；（++）：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為 26%～50%；（+++）：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞50%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

將所有患者的臨床資料、病理診斷結(jié)果輸入計(jì)算機(jī)，對(duì)年齡、性別和術(shù)后病理診斷等資料采用SPSS l3.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)，兩指標(biāo)間相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理診斷結(jié)果

甲狀腺乳頭狀癌52例，濾泡癌13例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者20例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者45例，濾泡性腺瘤15例。

2.2 Survivin的表達(dá)結(jié)果

Survivin在腫瘤旁正常甲狀腺組織無(wú)表達(dá)；在甲狀腺腺瘤主要在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，表達(dá)顏色較淺，陽(yáng)性表達(dá)率為20.0%（3/15）；在甲狀腺癌組織中Survivin也主要在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，但著色較深，陽(yáng)性表達(dá)率為61.5%（40/65）；在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中Survivin陽(yáng)性表達(dá)率為80.0%（16/20）。瘤旁甲狀腺組織與甲狀腺腺瘤中Survivin陽(yáng)性表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。瘤旁甲狀腺組織和甲狀腺腺瘤組織中Survivin陽(yáng)性表達(dá)與甲狀腺癌比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。良性腫瘤和惡性腫瘤及伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤兩組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.3 Smac的表達(dá)結(jié)果

Smac主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈淡黃色至棕黃色。在腫瘤旁正常甲狀腺組織中Smac均表達(dá)陽(yáng)性。在甲狀腺瘤中Smac陽(yáng)性表達(dá)率為86.7%（13/15），在甲狀腺癌組織中Smac陽(yáng)性表達(dá)率為 38.5%（25/65），兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中Smac陽(yáng)性表達(dá)率為40.0%（8/20），和不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 Survivin 和Smac在甲狀腺癌中的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

Survivin的表達(dá)與甲狀腺癌患者的性別、腫瘤大小和腫瘤病理類(lèi)型無(wú)關(guān)（P＞0.05），與年齡、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Smac的表達(dá)與年齡及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)（P＜0.05），而與性別、腫瘤大小、病理類(lèi)型、TNM 分期無(wú)關(guān)（P＞0.05），見(jiàn)表 1。

2.5 Survivin和Smac在甲狀腺癌中的相關(guān)關(guān)系

運(yùn)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析顯示兩種蛋白的表達(dá)具有負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

3 討論

細(xì)胞凋亡是機(jī)體新陳代謝或自我調(diào)節(jié)的一種重要方式，胱氨酸酶在凋亡機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，而凋亡蛋白抑制劑在功能上抑制胱氨酸酶的活性，但這種抑制作用可以被促凋亡蛋白和凋亡抑制蛋白所減弱、去除或增強(qiáng)，即促凋亡蛋白和凋亡抑制蛋白在腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程中扮演著重要的角色，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。Survivin屬于凋亡抑制蛋白家族成員，其基因是位于染色體17q25的同一基因族，在終末成熟組織中大多數(shù)都沒(méi)有表達(dá)，而在胎兒的心、肝、腎、胃、腸等多種胚胎組織中表達(dá)[2]，尤其在肺癌等多種惡性腫瘤中均有過(guò)表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為30%～100%[3]。Survivin是一種核穿梭蛋白，通過(guò)在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)間的主動(dòng)運(yùn)輸可構(gòu)成參與腫瘤的惡性演變過(guò)程[4]。Antonaci等[5]的研究成果表明，Survivin在甲狀腺腫瘤組織的表達(dá)高于正常組織，而且Survivin對(duì)確定小淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也能充當(dāng)有益的標(biāo)記。我們的研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致，Survivin在腫瘤旁正常甲狀腺組織無(wú)表達(dá)，在甲狀腺腺瘤中表達(dá)率較低，而在甲狀腺癌組織中Survivin表達(dá)率明顯增高，即隨著甲狀腺腫瘤由良性至惡性的發(fā)展，Survivin的表達(dá)呈現(xiàn)逐步上升趨勢(shì)。從Survivin在甲狀腺腫瘤中的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系中可以看出，Survivin的表達(dá)與甲狀腺癌患者的性別、腫瘤大小和腫瘤病理類(lèi)型無(wú)關(guān)，與年齡、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，該結(jié)果提示Survivin與甲狀腺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。

表1 Survivin和Smac在甲狀腺癌中的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

Smac是近期發(fā)現(xiàn)的一種促凋亡蛋白，2000年由Du等[6]發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，Smac被稱為第二個(gè)線粒體來(lái)源的胱氨酸酶激活劑。同年Verhagen等[7]從T細(xì)胞中分離出一種低等電點(diǎn)的IAP 直接結(jié)合蛋白（IAP binding protein with low p1，Diablo），經(jīng)對(duì)比分析，Smac與Diablo完全相同，是一種存在于線粒體并且調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì)。Smac/Diablo有Smac/Diablo-L，Smac/Diablo-S和野生型Smac/Diablo 3種存在形式。Smac/Diablo-L、S蛋白存在于線粒體內(nèi)，而野生型的Smac/Diablo蛋白以純二聚體的形式存在于線粒體的膜間隙內(nèi)。Smac在各種凋亡信號(hào)的刺激作用下從線粒體釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。研究表明Smac釋放的同時(shí)往往伴隨細(xì)胞色素C的釋放，并且Smac和IAP通過(guò)與胱氨酸酶競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合而抑制IAP的功能，因此共同促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。近年來(lái)，Smac/Diablo只誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而不影響正常細(xì)胞的特點(diǎn)引起了各國(guó)研究人員的注意。例如，Hunter等[8]研究發(fā)現(xiàn)，Smac/Diablo不能誘導(dǎo)健康的細(xì)胞凋亡，但是含有過(guò)量Smac的細(xì)胞能增加凋亡促進(jìn)藥物的敏感性，降低耐藥性。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道Smac/Diablo與某些腫瘤分期及進(jìn)展有一定的關(guān)系，Smac在腎癌等多種癌和肉瘤組織中的表達(dá)下降甚至不表達(dá)[9-10]，腫瘤惡性程度越高Smac/Diablo蛋白表達(dá)水平越低，無(wú)Smac表達(dá)的患者預(yù)后更差。Tirro等[11]發(fā)現(xiàn)泰素作用48 h后仍存活的甲狀腺癌細(xì)胞中c-IAP1和Survivin表達(dá)升高而Smac表達(dá)下降。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，Smac/Diablo蛋白在瘤旁正常甲狀腺組織和甲狀腺腺瘤中的陽(yáng)性表達(dá)率高于甲狀腺癌組織中Smac陽(yáng)性表達(dá)，與患者年齡明顯相關(guān)，但Smac表達(dá)與性別、腫瘤大小、病理類(lèi)型、TNM分期和是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)（P＞0.05），表明Smac在甲狀腺癌的表達(dá)下調(diào)可能與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展有一定的關(guān)系。應(yīng)用Spearman等級(jí)相關(guān)分析方法發(fā)現(xiàn)，Survivin和Smac的表達(dá)呈明顯的負(fù)相關(guān)，說(shuō)明Survivin和Smac在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中互相調(diào)節(jié)，共同參與甲狀腺乳頭狀癌的癌變過(guò)程。

綜上所述，Survivin和Smac的檢測(cè)對(duì)甲狀腺腫瘤的生物學(xué)行為評(píng)估和判斷預(yù)后具有重要意義，提示Snrvivin和Smac在甲狀腺良惡性腫瘤診斷和鑒別診斷中具有一定的價(jià)值。

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