楊震國 侯永清 丁斌鷹 王 蕾 劉玉蘭 朱慧玲

N-乙酰半胱氨酸對(duì)脂多糖刺激仔豬血漿炎性介質(zhì)的影響

楊震國 侯永清 丁斌鷹 王 蕾 劉玉蘭 朱慧玲

試驗(yàn)研究了乙酰半胱氨酸（NAC）對(duì)脂多糖（LPS）多次刺激造成的免疫應(yīng)激仔豬炎性介質(zhì)的影響，旨在探討NAC是否有緩解仔豬免疫應(yīng)激的作用。選取來源一致、體重相近的18頭健康仔豬[杜洛克×長白×大白，體重（11.58±0.26）kg]，隨機(jī)分成 3個(gè)處理（對(duì)照組、LPS組和NAC 組），每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭豬。對(duì)照組和LPS組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組（NAC組）為基礎(chǔ)日糧+500 mg/kg NAC，LPS組和NAC組仔豬分別于試驗(yàn)的第10、13、20 d腹膜注射100 μg/kg BW的LPS，對(duì)照組注射等量的滅菌生理鹽水。試驗(yàn)第10、20 d在注射LPS 3 h后前腔靜脈采血，測定血漿TNF-α、COR、IL-6和PGE2含量。試驗(yàn)結(jié)果顯示：日糧中添加NAC顯著緩解了LPS刺激導(dǎo)致的血漿（第10 d）和血漿（第20 d）中TNF-α、COR、IL-6和PGE2含量的升高（P＜0.05）。由此可見，在本試驗(yàn)條件下，LPS刺激引起仔豬血漿中炎性介質(zhì)升高，日糧中添加500 mg/kg NAC緩解LPS導(dǎo)致的血漿中炎性介質(zhì)的升高，緩解免疫應(yīng)激，最終可能緩解LPS刺激引起的生長抑制。

N-乙酰半胱氨酸；脂多糖；仔豬；免疫應(yīng)激；炎性介質(zhì)

現(xiàn)代畜牧生產(chǎn)過程中，仔豬在受到病原體或非病原體，如細(xì)菌、病毒和內(nèi)毒素（LPS）等作用時(shí)，免疫系統(tǒng)被激活，出現(xiàn)“免疫應(yīng)激”。免疫應(yīng)激導(dǎo)致白細(xì)胞介素-1（Interleukin-1，IL-1）、白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子-α（Tunor necrosis，TNF-α）等炎性細(xì)胞因子過度釋放，IL-1、IL-6和TNF-α等炎性細(xì)胞因子是引起畜禽生長抑制的主要因素[1-2]。因此，通過營養(yǎng)調(diào)控手段，添加一些營養(yǎng)物質(zhì)和調(diào)控因子，調(diào)節(jié)應(yīng)激仔豬的免疫反應(yīng)，特別是炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，對(duì)緩解仔豬免疫應(yīng)激導(dǎo)致的生長抑制，應(yīng)該是一條切實(shí)可行的途徑。乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）作為小分子物質(zhì)，易進(jìn)入細(xì)胞，生物利用率高。NAC在體內(nèi)脫乙?；傻陌腚装彼崾呛铣晒入赘孰模℅SH）的前體物質(zhì)，可以促進(jìn)GSH的合成，提高組織內(nèi)GSH含量[3]。研究表明，GSH參與了調(diào)節(jié)細(xì)胞增生、機(jī)體免疫應(yīng)答，也能抑制氧化應(yīng)激引起的急性和慢性炎癥反應(yīng)（Haddad J J等，2002）[4]。另有研究報(bào)道，NAC作為一種巰基供給體，具有抑制炎癥反應(yīng)的作用[3]。前期研究結(jié)果表明，日糧中添加500 mg/kg NAC能顯著緩解LPS應(yīng)激導(dǎo)致的仔豬生長抑制（胡堯等，2010）[5]。當(dāng)前，國內(nèi)外有關(guān)NAC的研究主要集中在抗氧化作用方面，多以小鼠為研究對(duì)象，關(guān)于乙酰半胱氨酸對(duì)脂多糖刺激仔豬免疫應(yīng)激的影響鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)通過對(duì)斷奶仔豬多次注射脂多糖建立免疫應(yīng)激模型（Johnson等，1994）[6]，研究NAC對(duì)仔豬的抗應(yīng)激作用，為NAC的應(yīng)用和免疫應(yīng)激的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

N-乙酰半胱氨酸：市售醫(yī)藥級(jí)產(chǎn)品，純度≥98%；大腸桿菌脂多糖（LPS）：大腸桿菌血清型055:B5（Sigma公司生產(chǎn)）。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)方法

選用18頭（35±2）日齡健康仔豬[杜洛克×長白×大白，體重（11.58±0.26）kg]，按隨機(jī)原則分成 3 個(gè)處理（對(duì)照組、LPS組、NAC組），每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭豬。預(yù)飼期7 d，正式試驗(yàn)期20 d。正式試驗(yàn)期間對(duì)照組和LPS組飼喂基礎(chǔ)日糧，NAC組在對(duì)照組日糧基礎(chǔ)上添加500 mg/kg NAC。于正式試驗(yàn)第10、13、20 d的上午 8:00點(diǎn)，LPS組和 NAC 組分別按100 μg/kg BW在仔豬腹膜下注射大腸桿菌脂多糖，對(duì)照組注射相應(yīng)劑量的滅菌生理鹽水。試驗(yàn)第10、20 d在注射LPS 3 h后前腔靜脈采血。

1.3 試驗(yàn)日糧與飼養(yǎng)管理

基礎(chǔ)日糧參照 NRC（1998）豬的營養(yǎng)需要（8～20 kg）配制，其組成及營養(yǎng)含量見表1。

試驗(yàn)期間豬舍室溫維持在22～25℃。仔豬在不銹鋼代謝籠中單體飼養(yǎng)，自由采食，乳頭式飲水器飲水，定時(shí)清掃和消毒豬舍。

表1 基礎(chǔ)日糧組成與營養(yǎng)含量（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.4 樣品采集

分別于試驗(yàn)第10、20 d注射LPS或生理鹽水3 h后前腔靜脈無菌采血，用10 ml肝素抗凝管收集，靜置15 min后以3 000 r/min離心10 min，取上清液保存至-80℃冰箱中，待測。

1.5 檢測指標(biāo)及方法

采用放射免疫分析法（RIA）測定血漿中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、前列腺素E2（PGE2）和皮質(zhì)醇（COR）濃度，TNF-α和COR試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所，IL-6和PGE2試劑盒購自北京華英生物技術(shù)研究所。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0進(jìn)行單因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）和Duncan's法多重比較，以P＜0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析（見表2）

由表2可知，LPS首次應(yīng)激時(shí)（第10 d）：與對(duì)照組相比，LPS 組 TNF-α、COR、IL-6、PGE2含量顯著升高（P＜0.05），NAC組TNF-α和IL-6差異不顯著（P＞0.05），COR和PGE2存在顯著差異（P＜0.05）；與LPS組相比，NAC組TNF-α、COR、IL-6、PGE2含量顯著降低（P＜0.05）。

表2 NAC對(duì)脂多糖刺激后仔豬血漿（10、20 d）中炎性介質(zhì)指標(biāo)的影響

仔豬經(jīng)3次LPS刺激后（第20 d）：與對(duì)照組相比，LPS組TNF-α、COR、IL-6、PGE2含量顯著升高（P＜0.05），NAC 組差異不顯著（P＞0.05）；與 LPS組相比，NAC 組TNF-α、COR、IL-6、PGE2含量顯著降低（P＜0.05）。

3 討論

LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁上的主要成分，易被胃腸道吸收入循環(huán)系統(tǒng)。LPS通過刺激單核-巨噬細(xì)胞合成和分泌大量的TNF-α、IL-1和IL-6等炎性細(xì)胞因子發(fā)揮作用，導(dǎo)致仔豬處于免疫應(yīng)激狀態(tài)，表現(xiàn)為動(dòng)物厭食、發(fā)燒、生長受阻[6]。相對(duì)于其它應(yīng)激物而言，LPS是模擬免疫應(yīng)激的理想物質(zhì)。

目前研究表明，免疫應(yīng)激期內(nèi)對(duì)機(jī)體物質(zhì)代謝具有特殊意義的細(xì)胞因子主要是IL-1、IL-6和TNF-α[7]。TNF-α和IL-6主要由單核-巨噬細(xì)胞在動(dòng)物機(jī)體感染和免疫早期合成和分泌的重要的前炎性細(xì)胞因子，在免疫應(yīng)激過程中起著關(guān)鍵的作用，LPS是它們較強(qiáng)的刺激劑之一。TNF-α可以通過某些途徑誘導(dǎo)其它炎性介質(zhì)（如IL-1、IL-6等）的生成，擴(kuò)大其生物學(xué)效應(yīng)，從不同環(huán)節(jié)在體內(nèi)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)和組織損傷。IL-6具有多種生物學(xué)活性，在急性期反應(yīng)中刺激肝細(xì)胞蛋白質(zhì)合成，是一種內(nèi)源性致熱原（王蕾，2009）[8]。另外，IL-6與感染和組織損傷有關(guān)，其部分生物活性與IL-1相似（Wong等，1988）[9]。因此，IL-6 也可以是感染和組織損傷的預(yù)警指標(biāo)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，由免疫應(yīng)答引起的代謝變化是由細(xì)胞因子（IL-1、IL-6、TNF-α等）進(jìn)行調(diào)節(jié)的[10]。在本試驗(yàn)條件下，首次（第10 d）和第3次（第20 d）LPS刺激均能導(dǎo)致血漿中TNF-α和IL-6含量顯著升高，這與Li等[11]結(jié)果相似，表明LPS首次和多次刺激后均能使機(jī)體免疫反應(yīng)過度，導(dǎo)致機(jī)體損傷。本試驗(yàn)中，與吳虎山等（2005）[12]和靳海英等（2007）[13]研究結(jié)果相吻合，日糧中添加500 mg/kg NAC緩解LPS導(dǎo)致的血漿中TNF-α和IL-6水平升高，說明NAC可在一定程度上緩解LPS刺激導(dǎo)致的仔豬炎癥反應(yīng)。其可能作用機(jī)理如下：

外源性還原型谷胱甘肽或其前體N-乙酰半胱氨酸均可通過提高細(xì)胞中谷胱甘肽水平，抑制IκB磷酸化，從而抑制核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）活化[14]。NF-κB含有多種細(xì)胞因子基因啟動(dòng)子（如TNF-α、IL-1和IL-6等）部位的κB結(jié)合位點(diǎn)，調(diào)節(jié)細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子。NF-κB活性被抑制后，其調(diào)控轉(zhuǎn)錄的炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6產(chǎn)生、釋放也相應(yīng)的減少，最終趨向平衡，免疫應(yīng)激得到緩解[15]。

COR是負(fù)反饋調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的重要成分，也是應(yīng)激反應(yīng)的重要標(biāo)志之一，可防止免疫反應(yīng)過度造成對(duì)機(jī)體的損害。當(dāng)機(jī)體發(fā)生應(yīng)激時(shí)，皮質(zhì)醇水平相應(yīng)升高，促進(jìn)蛋白質(zhì)和脂肪分解以動(dòng)員能量，增加動(dòng)物對(duì)應(yīng)激的適應(yīng)能力[16]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，首次（第10 d）和第3次（第20 d）注射LPS后，和劉玉蘭等[17]的研究結(jié)果一致，LPS組血漿中COR的含量均顯著增加（P＜0.05），表明LPS首次和多次刺激后均能導(dǎo)致機(jī)體免疫應(yīng)激。而日糧中添加500 mg/kg NAC降低血漿和小腸粘膜中COR水平（P＜0.05），說明NAC可緩解LPS刺激導(dǎo)致的機(jī)體免疫應(yīng)激。

PGE2是一種重要的調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的炎性介質(zhì)，是機(jī)體損傷后免疫功能抑制與分解代謝亢進(jìn)的重要始動(dòng)因素之一，其過度產(chǎn)生、釋放與感染過程中細(xì)菌、內(nèi)毒素對(duì)單核巨噬細(xì)胞的作用有關(guān)[18,8]，在免疫應(yīng)激過程中充當(dāng)信使角色（劉玉蘭，2004）[17]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，首次應(yīng)激后（第10 d），LPS組血漿中PGE2的含量顯著增加（P＜0.05），這和劉玉蘭[19]的研究結(jié)果一致；第三次注射LPS后（第20 d），血漿中PGE2的含量均顯著增加（P＜0.05），表明LPS首次和多次刺激后導(dǎo)致機(jī)體炎性介質(zhì)增多。Rietschel等[20]研究報(bào)道，LPS作為一種強(qiáng)烈的刺激因子，其作用強(qiáng)度與單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生PGE2效應(yīng)成正相關(guān)。本試驗(yàn)中，日糧中添加500 mg/kg NAC顯著降低血漿中PGE2水平（P＜0.05），說明NAC可緩解LPS刺激導(dǎo)致的仔豬機(jī)體炎性介質(zhì)的增多，進(jìn)而緩解營養(yǎng)物質(zhì)從維持生長向緩解免疫應(yīng)激的轉(zhuǎn)移。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，LPS刺激引起免疫應(yīng)激，日糧中添加500 mg/kg NAC可緩解LPS導(dǎo)致的血漿中炎性因子的升高，緩解免疫應(yīng)激，進(jìn)而緩解LPS刺激引起的生長抑制。

[1] Van Deuren M,Dofferhoff A S M,van Der Meer J W M.Cytokiness and the response to infection[J].1992,168:349-356.

[2] 劉堅(jiān),侯永清,丁斌鷹,等.α-酮戊二酸對(duì)脂多糖應(yīng)激斷奶仔豬生長抑制的緩解作用[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào),2009,21（4）:519-524.

[3] 喬玲,李亞明,段鐘平.N-乙酰半胱氨酸的作用機(jī)制及在肝病中的應(yīng)用[J].醫(yī)學(xué)綜述,2007,13（1）:39-41.

[4] Haddad J J,Land S C.Redox signaling-mediated regulation of lipopolysaccharide-induced proinflammatory cytokine biosynthesis in alveolar epithelial cells [J].Antioxid Redox Signal,2002,4（1）:179-193.

[5] 胡堯,張麗麗,侯永清,等.N-乙酰半胱氨酸對(duì)脂多糖應(yīng)激仔豬生長性能及血漿生化指標(biāo)的影響[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào),2010,22（4）:1007-1011.

[6] Johnson R W,E von Borell.Lipoplysaccharide-induced sickness behavior in pigs is inhibited by pretreament with indomethacin[J]..J.Anim.Sci.,1994,72:309-314.

[7]張乃峰.蛋白質(zhì)與氨基酸營養(yǎng)對(duì)早期斷奶犢牛免疫相關(guān)指標(biāo)的影響[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2008.

[8] 王蕾.α-酮戊二酸對(duì)脂多糖刺激仔豬肌肉和腸黏膜組織生長與代謝的影響及其分子機(jī)理影響[D].武漢:武漢工業(yè)學(xué)院,2009.

[9] Wong G G,Clark S C.Multiple actions interleulin-6 within a cytokine network[J].Immunol Today,1988,137:9-14.

[10] Webel D M,Finck B N,Baker D H,et al.Time course of increased plasma cytokines,cortisol,and urea nitrogen in pigs following intraperitoneal injection of lipopolysaccharide[J].J Anim Sci.,1997,75:1514-1520.

[11] Li J,Li D F,Xing J J,et al.Effects of β-glucan extracted from saccharomyces cerevisiae on growth performance,and immunological and somatotropic responses of pigs challenged with Escherichia coli lipopolysaccharide[J].Journal of Animal Science,2006,84:2374-2381.

[12] 吳虎山,李靈敏,苗宇船.N-乙酰半胱氨酸對(duì)脂多糖所致枯否細(xì)胞功能改變的影響[J].山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2005,6（1）:49-51.

[13] 靳海英,任鋒,丁美,等.N-乙酰半胱氨酸對(duì)豬急性肝衰竭血清腫瘤壞死因子-α、白介素-1β 的影響[J].藥品評(píng)價(jià),2007,4（3）:153-156.

[14] Bdldwin A S Jr.Series introduction:the transcription factor N F-kappaB and human disease[J].J Clin Invest,2001,107（1）:3-6.

[15] Rahman I.Regulation of nuclear factor-kappaB,activator protein-1,and glutathione levels by tumor necrosis factor-alpha and dexamethasone in alveolar epithelial cells[J].Biochem Pharmacol,2000,60（8）:1041-1049.

[16] 程忠剛，林映才，周桂蓮，等，大豆黃酮對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能、血清免疫指標(biāo)和激素水平的影響 [M].第四屆全國豬營養(yǎng)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集,2008:348-352.

[17] 劉玉蘭,李德發(fā),龔利敏,等.免疫應(yīng)激對(duì)斷奶仔豬免疫和神經(jīng)內(nèi)分泌激素的影響[J].中國畜牧雜志,2004,4（40）:4-6.

[18] Stephan R N,Conrad P J,Saizawa M,et al.Prostaglandin E2depressesantigen-presentingcellfunctionofperitonealmacrophages[J].The Journal of Surgical Research,1988,44（6）:733-739.

[19] 劉玉蘭.魚油對(duì)斷奶仔豬抗免疫應(yīng)激機(jī)理研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué),2003.

[20] Rietschel E T,Schade U,Jensen M,et al.Bacterial endotoxins:chemical structure biological activity and role in septicaemia[J].Scand J Infect Dis,1982,31:8.

S816.32

A

1001-991X（2011）09-0030-03

楊震國，武漢工業(yè)學(xué)院動(dòng)物營養(yǎng)與工程學(xué)院，飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，430023，湖北省武漢市漢口常青花園學(xué)府南路68號(hào)。

侯永清（通訊作者）、丁斌鷹、王蕾、劉玉蘭、朱慧玲，單位及通訊地址同第一作者。

2010-11-15

武漢市學(xué)術(shù)帶頭人計(jì)劃項(xiàng)目[200951830554]，湖北省自然科學(xué)基金計(jì)劃創(chuàng)新群體項(xiàng)目[2007ABC009]，湖北省高等學(xué)校優(yōu)秀中青年團(tuán)隊(duì)計(jì)劃項(xiàng)目[T200810]

（編輯：王 芳，xfang2005@163.com）