劉莎莎 譚建莊 孫 哲 沈景林 張宏福

轉基因成分在肉雞體內(nèi)的代謝殘留及對生化指標、器官發(fā)育的影響

劉莎莎 譚建莊 孫 哲 沈景林 張宏福

試驗選擇1日齡AA肉仔雞720只，隨機分成4個處理組，用含有27%（25%）、36%（34%）的抗草甘膦轉基因豆粕日糧和常規(guī)豆粕日糧飼喂肉雞，通過檢測其肝臟、腎臟、脾臟、胸肌、腿肌、十二指腸、空腸和回腸的轉基因成分，探討飼料中轉基因成分在家禽體內(nèi)的代謝殘留狀況，同時研究了抗草甘膦轉基因豆粕對肉雞血清生化指標和器官發(fā)育的影響，結果表明，以定性PCR檢測的轉基因豆粕日糧肉雞的八種樣品（肝臟、腎臟、脾臟、胸肌、腿肌、十二指腸、空腸和回腸）中沒有CP4-EPSPS外源基因成分，同時綜合分析表明，轉基因豆粕對肉雞的血清生化指標和器官發(fā)育沒有顯著差異，在試驗中轉基因豆粕沒有在肉雞體內(nèi)殘留，對生化指標和器官發(fā)育沒有顯著差異。

轉基因豆粕；肉仔雞；代謝殘留；生化指標；器官發(fā)育

轉基因作物的產(chǎn)生緩和了畜禽、耕地與糧食的矛盾問題，但目前生物技術發(fā)展的還不是很完善，其局限之一是目的基因的插入帶有隨機性，那么這種隨機性的插入就為農(nóng)作物及其產(chǎn)物的安全使用畫上問號，可能會在今后的實際生產(chǎn)中對人類或者畜禽產(chǎn)生各種“非期望效應”。轉基因作物及其產(chǎn)物使用的前提是保證其安全性，而制定轉基因作物安全性評價體系就是保證轉基因技術發(fā)展和轉基因作物使用的推動因素?，F(xiàn)在已經(jīng)有60%～70%的飼料與轉基因有關，這些飼料飼喂的畜禽或者其產(chǎn)品的終端是人，所以轉基因作物飼用安全性評價體系是安全性評價體系中重要一環(huán)。動物營養(yǎng)的研究者一直在對轉基因作物飼用安全性進行研究，其中與飼料有關的包括轉基因大豆、玉米、油菜籽、棉籽等，涉及到的動物既有單胃動物，也有反芻動物。

轉基因作物及其產(chǎn)物的飼用安全性評價意義重大，篩選敏感的指標與合適測量方法是評價體系的重點。本試驗以AA肉雞為飼養(yǎng)動物，以抗草甘膦轉基因豆粕為飼料原料配制日糧，試驗設置2個水平轉基因豆粕日糧處理組，檢測對肉雞血清生化指標和器官發(fā)育的影響，及其轉基因成分在肉雞體內(nèi)組織器官中的代謝情況，同時觀察日糧中轉基因作物的添加量對肉雞是否有影響，以期篩選到更為敏感的評價指標，進而用于評價轉基因豆粕的飼用安全性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

抗草甘膦的轉基因豆粕為孟山都Roundup-Ready抗草甘膦基因大豆（40-3-2），購買自秦皇島金海糧油工業(yè)有限公司，常規(guī)非轉基因豆粕為國產(chǎn)大豆，購買自黑龍江慶豐集團克山昆豐油脂有限公司。

1.2 試驗設計

1.2.1 日糧配制及營養(yǎng)水平

試驗日糧配制根據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T33—2004《雞飼養(yǎng)標準》中肉雞營養(yǎng)需要，參照測定的豆粕中各營養(yǎng)成分含量配制日糧，由于標準中是將肉雞的飼養(yǎng)劃分為2個階段，而兩個階段的蛋白質和能量的含量也不一樣，試驗分組如下：轉基因組27%（25%），非轉基因組27%（25%），轉基因組36%（34%），非轉基因36%（34%）。日糧組成及營養(yǎng)水平見表1、表2。

表1 21日齡日糧組成及營養(yǎng)水平

日糧配制說明：轉基因豆粕日糧與常規(guī)豆粕日糧粗蛋白與代謝能通過添加非轉基因玉米、玉米蛋白粉和玉米油的含量來配平。

1.2.2 試驗動物選擇及試驗設計

試驗選擇1日齡AA肉雞720只，隨機分成4個處理組，每個處理組5個重復，用含有27%（25%）、36%（34%）的抗草甘膦轉基因豆粕日糧和常規(guī)豆粕日糧飼喂肉雞。試驗分為1～21、22～42兩個階段，每個階段各處理組日糧營養(yǎng)水平一致，試驗雞自由采食粉料、自由飲水，籠養(yǎng)，記錄階段采食量和體重。分別于21日齡和42日齡，每個重復隨機挑選3只接近平均體重的雞進行屠宰，翅靜脈采血，制備血清，測定臟器器官指數(shù)，用滅菌刀片和剪刀快速取相同部位十二指腸、空腸、回腸、肝臟、腎臟、脾臟、胸肌和腿肌放入Axgen離心管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 42日齡日糧組成及營養(yǎng)水平

避免在PCR過程中出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象，采用轉基因豆粕中的凝集素基因片段（Lec）和以雞卵白蛋白基因（ov）分別作為豆粕和肉雞樣品中DNA提取效果的陽性對照。采用cp4-epsps基因片段特異的引物對肉雞樣品DNA進行擴增，檢測外源基因是否在肉雞體內(nèi)代謝殘留。

2 檢測指標與方法

2.1 血液生化指標的測定

血清生化指標采用日立H7600-020型全自動生化分析儀測定，三碘甲狀腺原氨酸（T3）和甲狀腺素（T4）測定采用ELISA的方法，試劑盒購買于中國原子能科學研究院。數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件Spss16.0版中單因素方差分析和LSD法進行差異顯著性檢驗。

2.2 器官指數(shù)

器官指數(shù)的測定方法參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《NY/T823—2004家禽生產(chǎn)性能名詞術語和度量統(tǒng)計方法》。數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件spss16.0版中單因素方差分析和LSD法進行差異顯著性檢驗。

器官指數(shù)（g/kg）=器官重量（g）/活體重（kg）

2.3 外源DNA的PCR檢測

2.3.1 DNA提取

轉基因豆粕陽性標準品、肉雞組織樣品中DNA提取按照DNeasy Plant Mini Kit和QIAamp DNA Stool Mini Kit（Qiagen公司）提取試劑盒中的說明進行。

DNA提取后采用Spectrophotometer DNA定量儀（Thermo公司生產(chǎn)）測定提取DNA樣品的濃度，并以OD260～280nm檢測提取DNA的純度。將DNA樣品用ddH2O稀釋至 40～50 ng/μl，-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 PCR擴增條件

2.3.2.1 PCR引物

所有引物為Invitrogen公司合成，引物序列及擴增長度見表3。

表3 引物序列及擴增產(chǎn)物

2.3.2.2 PCR反應體系

PCR反應設置水空白對照、陽性對照、待測樣品，每個樣品做3次重復。反應體系（見表4）中采用Taq DNA 聚合酶、dNTP mixture、10×Taq buffer 和 DNA maker、溴酚藍（fermenter公司提供）。

表4 擴增基因片段的PCR反應體系

2.3.2.3 PCR反應條件

CE基因反應條件：模板DNA在95℃下預變性5 min（94℃變性 30 s，58℃退火 1 m，72℃延伸 45 s），35個循環(huán)，72℃保溫5 min，4℃保存。

Lec基因反應條件：模板DNA在95℃下預變性5 min（94℃變性 30 s，60℃退火 1 m，72℃延伸 45 s），40個循環(huán)，72℃保溫10 min，4℃保存。

ov基因反應條件：模板DNA在94℃下預變性3 min（96℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s），35個循環(huán)，72℃保溫5 min，4℃保存（Jennings）。

2.3.3 PCR產(chǎn)物電泳

各取10 μl的PCR產(chǎn)物，加入1 μl的溴酚藍混勻，在加入goldview的2%瓊脂糖凝膠和0.5×TB緩沖液中，100 V恒壓下電泳1.5 h，于VIBERT LOURMAT凝膠成像系統(tǒng)照相記錄。

3 結果與分析

3.1 轉基因豆粕營養(yǎng)成分分析

抗草甘膦轉基因豆粕與常規(guī)豆粕的常規(guī)營養(yǎng)成分見表5。從表5中可以看出抗草甘膦轉基因豆粕與常規(guī)非轉基因豆粕的粗蛋白含量和粗脂肪含量存在較大差異，其他營養(yǎng)成分也存在差異。

表5 轉基因豆粕與常規(guī)營養(yǎng)成分分析（%）

3.2 轉基因豆粕對肉雞生產(chǎn)性能的影響（見表6）

表6 轉基因豆粕對肉雞生產(chǎn)性能的影響

從統(tǒng)計結果看，21 d時27%（25%）和36%（34%）轉基因豆粕日糧對肉雞的日增重、日采食量和料肉比與各自對照組比較沒有差異（P＞0.05）；在42 d時，兩組轉基因處理組均比其對照組的日增重和日采食量高，統(tǒng)計結果差異顯著（P＜0.05），但是料重比在處理組之間沒有差異（P＞0.05）。

3.3 轉基因豆粕對肉雞血清生化指標的影響（見表7）

本試驗測定了肉雞血清中6種酶活性、鈣、磷、葡萄糖、尿酸、總膽固醇、甲狀腺素和三碘甲狀腺原氨酸含量等13個指標。結果表明，21 d兩個水平轉基因豆粕組與各自對照組比較測定的13個血清生化指標均無顯著差異（P＞0.05）；42 d時轉基因豆粕組（36%/34%）與對照組比較丙氨酸轉氨酶和堿性磷酸酶有顯著差異（P＜0.05），其他指標無顯著差異（P＞0.05），轉基因豆粕組（27%/25%）與其對照組的血清生化指標均無顯著差異（P＞0.05）。

3.4 轉基因豆粕對肉雞器官發(fā)育的影響（見表8）

試驗測定的8個器官指數(shù)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計表明21 d時肉雞兩個添加水平轉基因豆粕日糧組分別與其對照組間沒有顯著差異（P＞0.05）；42d時36%/35%轉基因組與其對照組間嗉囊指數(shù)有顯著差異（P＜0.05），其他7個器官指數(shù)沒有顯著差異（P＞0.05），27%/25%轉基因組與對照組比較8個器官指數(shù)均無顯著差異（P＞0.05）。

表7 轉基因豆粕對肉仔雞血清生化指標的影響

表8 轉基因豆粕對肉雞器官發(fā)育的影響（g/kg）

3.5 外源DNA代謝殘留檢測

采用cp4-epsps基因片段特異的引物對轉基因豆粕的總DNA進行了擴增，瓊脂糖凝膠電泳后顯示出特異性條帶，說明本試驗所用的豆粕確實為抗草甘膦轉基因豆粕，也表明試驗擴增cp4-epsps基因146 bp片段所采用的PCR體系和程序合適。從肉雞的樣品擴增肉雞ov基因為陽性內(nèi)對照，電泳得到396 bp的預期擴增片段，表明模板DNA質量較高，適合用于PCR擴增，所用PCR反應條件和方法適當。對肉雞樣品總DNA用cp4-epsps特異性引物進行PCR擴增，均未擴增出cp4-epsps基因146 bp片段，結果如圖1～5所示，結果表明轉基因豆粕中的外源基因未向肉雞的器官、肌肉和小腸壁中轉移和累積。

4 討論

4.1 轉基因豆粕營養(yǎng)成分分析及對肉雞生產(chǎn)性能的影響

根據(jù)實質等同性原則，對轉基因作物的營養(yǎng)成分進行分析是安全性評價的重要方面。試驗結果得出抗草甘膦轉基因豆粕與常規(guī)非轉基因豆粕的粗蛋白含量和粗脂肪含量存在較大差異，這有可能是由于兩種大豆在油脂提取過程中的條件不同造成的，其他營養(yǎng)成分近似，另外與《中國飼料原料數(shù)據(jù)庫》中豆粕的營養(yǎng)成分也存在差異，所以試驗所用兩種豆粕不具有實質等同性。杜紅方等試驗測定轉基因糙米與非轉基因糙米營養(yǎng)成分也存在差異，其中粗蛋白含量差異最大。

圖1 豆粕Lec基因和cp4-epsps基因PCR產(chǎn)物

圖2 21 d肉雞ov基因PCR產(chǎn)物

自從轉基因作物產(chǎn)生以來，已經(jīng)有大量學者對轉基因作物的營養(yǎng)成分進行分析，他們使用的是轉基因作物與其親本對照，多數(shù)研究結果表明這兩者具有實質等同性。Padgette等研究抗除草劑轉基因大豆的種子和豆粕中常規(guī)營養(yǎng)成分，結果顯示營養(yǎng)成分無差異。Taylor等和Cromwell等研究抗除草劑轉基因大豆與其親本具有實質等同性。

圖3 42 d肉雞ov基因PCR產(chǎn)物

圖4 21 d雞的8種器官組織cp4-epsps基因PCR產(chǎn)物

圖5 42 d雞的8種器官組織cp4-epsps基因PCR產(chǎn)物

試驗中測定轉基因豆粕粗蛋白比非轉基因常規(guī)豆粕高，但是粗脂肪較低，進行飼養(yǎng)試驗測定生產(chǎn)性能發(fā)現(xiàn)42 d兩個水平轉基因組的日采食量和日增重分別高于各自對照組，產(chǎn)生的原因可能是因為在配置日糧時為使各處理組日糧的營養(yǎng)水平達到一致，轉基因豆粕組日糧的玉米和玉米油添加量高于對照組，提高了日糧的適口性而造成的。Piva等研究結果表明飼喂抗蟲轉基因玉米的仔豬體增重和料肉比高于對照組，同時Taylor等飼喂肉雞也得出這樣的結論，認為是抗蟲轉基因玉米的生長過程受到病害破壞較少，從而使玉米中的霉菌毒素含量減少所致。

4.2 轉基因豆粕對肉雞血清生化指標和器官發(fā)育的影響

血清生化指標是衡量動物健康狀況與機體代謝的重要指標，器官發(fā)育指數(shù)反映動物機體及器官正常生長發(fā)育的主要指標。杜紅方等測定的血清指標和器官指數(shù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計表明，飼喂肉雞含轉基因水稻日糧組與對照組比較無顯著差異，其結果與多位研究學者的結論一致；陳小萍等、李英華等飼喂轉基因大米給大鼠檢測血清生化指標和器官指數(shù)，結果表明試驗組與對照組之間也沒有顯著差異。Toney等、Brake等分別用不同的轉基因玉米日糧飼喂肉仔雞和大鼠，表明多項血清生化指標沒有受到日糧中轉基因成分的影響。楊月欣等開展了轉基因大米對小型豬健康狀況影響的研究，小型豬的血清生化指標和器官指數(shù)也沒有受到轉基因成分的影響。但是周聯(lián)高發(fā)現(xiàn)轉基因稻谷飼喂肉雞，轉基因組堿性磷酸酶活性顯著低于對照組，但后期效果不明顯。本試驗42 d轉基因豆粕36%/34%日糧組的丙氨酸轉氨酶和堿性磷酸酶含量與其對照組有顯著差異，同時嗉囊指數(shù)間也存在顯著差異，但從目前所掌握的肉雞丙氨酸轉氨酶和堿性磷酸酶含量數(shù)據(jù)表明本試驗中的數(shù)據(jù)變異還在正常變異范圍之內(nèi)，屬于沒有生物學意義上的差異；而嗉囊指數(shù)僅在42日齡具有的變異也正直接反映了肉雞為能而食的特點及臟器對采食行為的一個逐步調(diào)整適應的過程。

4.3 外源DNA殘留檢測

這部分的研究目的在于檢測飼料中轉基因成分是否水平轉移到肉雞機體，驗證飼料中轉基因成分是否殘留而進入人類食物鏈，進而對人類健康產(chǎn)生威脅。目前為止令人欣喜的是眾多研究結果顯示：植物內(nèi)源DNA片段可在脾臟、肝臟等器官中檢測到，但是未發(fā)現(xiàn)轉入的外源基因片段。Tony等研究Bt176轉基因玉米的葉綠體基因和Bt基因在肉雞體內(nèi)的殘留，在組織中檢測到短片段的葉綠體基因，而所有組織均未檢測到Bt基因片段。Einspanier等、Rossi等以肉雞作物研究動物試驗結果都得到相同結果。Ash等檢測飼喂抗草甘膦轉基因豆粕日糧蛋雞的雞蛋和肝臟中外源基因，結果也未發(fā)現(xiàn)殘留現(xiàn)象。但常有報道指出在動物腸道內(nèi)容物中檢測出外源基因，這是因為任何飼料及其原料都不可能在消化道內(nèi)完全被消化。朱元招等用含30%RR轉基因豆粕的日糧飼喂生長豬，結果外源基因的DNA片段從回腸末端食糜與糞便中檢出率為6.7%。Chowdhury等飼喂豬轉Bt基因玉米后，在腸道內(nèi)容物中檢測到Bt基因片段。Phipps等飼喂轉基因豆粕和玉米日糧給奶牛，在瘤胃液和十二指腸內(nèi)容物中檢測到外源基因。試驗檢測的肉雞21 d和42 d樣品中，PCR結果沒有發(fā)現(xiàn)抗草甘膦抗性基因cp4-epsps的DNA片段，理論上是被肉雞消化、降解了，也可能是因為使用的轉基因原料在適用范圍內(nèi)，而且外源基因在植物基因組中所占比例很小，能夠被動物完全消化降解，而不會殘留在體內(nèi)進入人類食物鏈。

5 結語

5.1 轉基因豆粕的營養(yǎng)成分分析結果與常規(guī)豆粕不具有實質等同性。21 d處理組之間生產(chǎn)性能差異不顯著；42 d兩個水平轉基因豆粕日糧的肉雞日采食量和日增重比對照組高，料肉比差異不顯著。

5.2 轉基因豆粕（36%/34%）組與對照組相比發(fā)現(xiàn)，21 d時13個血清生化指標和8個器官指數(shù)均無顯著差異，42 d時肉雞丙氨酸轉氨酶、堿性磷酸酶含量和嗉囊指數(shù)有顯著差異，其他器官指數(shù)和血清生化指標沒有差異；轉基因豆粕組（27%/25%）在兩個試驗期與對照組比較肉雞血清生化指標和器官指數(shù)均無顯著差異，綜合看來試驗期內(nèi)，轉基因豆粕對肉雞健康狀況和器官發(fā)育無明顯不良影響。

5.3 以定性PCR檢測試驗肉雞的樣品（肝臟、腎臟、脾臟、胸肌、腿肌、十二指腸、空腸和回腸），沒有發(fā)現(xiàn)cp4-epsps外源基因成分，說明轉基因成分沒有殘留在肉雞體內(nèi)。

在試驗期內(nèi)，轉基因豆粕對肉雞健康狀況和器官發(fā)育無明顯不良影響，轉基因成分也沒有在肉雞體內(nèi)殘留。試驗使用的原則與目前世界各國研究者使用的原則一樣，即“實質等同性原則”得出的結論也是一致的，但對轉基因作物和采食這些飼料的動物的安全性評價還需要更深入系統(tǒng)的研究，需要更好的檢測手段和方法，并還需要時間的檢驗。

S816.3

A

1001-991X（2011）09-0019-07

劉莎莎，吉林大學農(nóng)學部，130062，吉林省長春市綠園區(qū)西安大路5333號吉林大學農(nóng)學部7號公寓。

譚建莊、孫哲、張宏福（通訊作者），中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所。

沈景林，單位及通訊地址同第一作者。

2011-03-28

轉基因生物新品種培育重大專項“轉基因生物的食用和飼用安全評價技術[2008ZX0811-005]”；國家肉雞產(chǎn)業(yè)技術體系[CARS-42]

19篇，刊略，需者可函索）

（編輯：劉敏躍，lm-y@tom.com）