朱國琴 張 聰 蔡國琴 王建新

1.復旦大學藥學院，上海 201203；2.上海市中藥研究所，上海 201401

珍菊降壓片系中西藥物復方降壓制劑，由野菊花浸膏、珍珠層粉及蘆丁三味中藥（或提取物）和氫氯噻嗪與鹽酸可樂定兩味西藥成分組成，是臨床上治療輕中度原發(fā)性高血壓的常用藥物之一[1]。高血壓病作為臨床上的常見病、多發(fā)病，長期服用有效的降壓藥，仍是目前防治的主要措施之一。雖然目前臨床上用于抗高血壓的藥物較多，化學藥物雖然起效較快，但普遍存在較大的副作用；中藥藥性較為溫和，但相對來說起效較慢，效果不夠顯著。珍菊降壓片就是在將中西藥物的特點結(jié)合起來的思路指導下研制而成的，諸多臨床試驗也證實了其組方的合理性，無論是單獨作為降壓藥，還是與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用，都表現(xiàn)出了良好的效果。方中用野菊花清熱降火、清利頭目、平肝降壓；珍珠層粉平肝潛陽、安神定驚、清熱明目，共為主藥。鹽酸可樂寧具有中樞降壓作用，氫氯噻嗪為利尿降壓藥，共為輔藥。蘆丁降低毛細血管通透性，增加其張力為佐使藥，諸藥合用共奏平肝、潛陽、清熱、降壓之功。黃琳紅等[2]進行的腎性高血壓大鼠實驗顯示，珍菊降壓片有良好的抗高血壓作用，且未出現(xiàn)西藥組分引起的停藥后血壓反跳現(xiàn)象，對血脂和血脂蛋白無顯著性影響，說明中藥組分對抗了西藥組分的不良反應(yīng)。但目前關(guān)于珍菊降壓片等中西復方制劑的中西藥物配伍應(yīng)用作用機制研究報道很少[3]，本研究采用血清藥理學的方法，通過拆方研究，探討珍菊降壓片中西藥物配伍后對高血壓相關(guān)基因表達的影響，探討其配伍機理。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 ICR小鼠（SHR）80只，雌雄各半，體重18～20 g，購自中英合資上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，許可證號：SYXK（滬）2003-0029。

1.1.2 受試藥物 珍菊降壓片原料藥（簡稱：復方，下同），土褐色粉末，由上海雷允上藥業(yè)有限公司提供，將野菊花膏粉、珍珠層粉、蘆丁、氫氯噻嗪、鹽酸可樂定按100∶100∶20∶5∶0.03比例混勻，然后用0.5%CMC蒸餾水液調(diào)配成1.4%的藥液，備用。

1.1.3 對照藥物 對照藥物1∶珍菊降壓片中藥部分（簡稱∶中藥，下同），土褐色粉末，由上海雷允上藥業(yè)有限公司提供，將野菊花膏粉、珍珠層粉、蘆丁按100∶100∶20比例混勻，然后用0.5%CMC蒸餾水液調(diào)配成1.37%的藥液，備用。對照藥物2：珍菊降壓片西藥部分（簡稱：西藥，下同）白色粉末，由上海雷允上藥業(yè)有限公司提供，將氫氯噻嗪、鹽酸可樂定按500：3比例混勻，然后用0.5%CMC蒸餾水液調(diào)配成0.03%的藥液，備用。

1.1.4 細胞株 人臍靜脈內(nèi)皮細胞株ECV-304，來源于復旦大學遺傳工程國家重點實驗室。

1.1.5 試劑 流式細胞儀檢測用試劑：碘化丙碇（鼎國），triton-X100（生工）芯片檢測用試劑：GeneChip Expression 3’Amolication One-Cycle Target Labeling and Control Reagents（Affymetrix）；RNeasy Mini Kit（50）（QIAGEN）；Trizol（Invitrogen）；DEPC-water（Ambion）；Herring Sperm DNA（Promega）；BSA（Inventrgen）；MOPS（Sagon）；β-Mercaptoethanol（Sagon）；Normal Goat IgG（Sigma）；Biotinylated Antibody（VectorLabs）；MEA Free Acid Monohydrate SigmaUltra（Sigma-Aldrich）；MES sodium salt（Sigma-Aldrich）；10%Tween-20（Pierce）；SSPE（Cambrex）；R-Phycoerythrin Streptavidin（Invitrogen）；DMSO（Sigma）

1.1.6 基因芯片 Human Genome Y133 Plus 2.0（Affymetrix）。

1.1.7 檢測儀器 高速離心機（LABOFUGE400R型）；電子天平（AL204型，Metter Toledo）；熒光倒置顯微鏡（XDS-1B，重慶光電儀器廠）；流式細胞儀（FCESCalibur型，B&D）；GeneChip System（Affymetrix）。

1.2 實驗方法

將ICR小鼠按體重分為4組，每組20只，設(shè)復方組，復方組分中相應(yīng)劑量中藥組、西藥組，空白對照組。復方、中藥、西藥三組分別灌胃給予復方280 mg/kg、中藥274 mg/kg、西藥6.2 mg/kg，空白對照組灌胃給同體積0.5%CMC蒸餾水液20 mL/kg，每日1次，連續(xù)7 d。末次給藥后2 h，小鼠眼眶動脈處取血，血液凝固、收縮后，4℃狀態(tài)下離心，分離含藥血清，備用。

選取生長狀況最好的ECV-304人臍靜脈內(nèi)皮細胞1傳4，24 h后，將中藥、西藥、復方及對照組動物血清過濾，分別取250μL血清加入至含10%胎牛血清的5 mL培養(yǎng)基中，使其終濃度為5%，于37℃孵育箱培養(yǎng)，24 h后觀察細胞表型，用熒光倒置顯微鏡拍攝細胞形態(tài)，流式細胞儀檢測細胞周期，并抽提ECV-304細胞RNA，反轉(zhuǎn)錄，Cy3標記和Cy5標記，送樣作Affimatrix表達譜芯片分析。

2 實驗結(jié)果

2.1 細胞表型變化

熒光倒置顯微鏡下觀測可見，ECV-304細胞經(jīng)含藥血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，其形態(tài)與生長密度無明顯改變，但各組細胞內(nèi)的顆粒物有所增加，說明珍菊降壓片在動物體內(nèi)代謝后釋放入血清的物質(zhì)會影響細胞表型，但無明顯毒性。細胞的熒光照片見圖1。

圖1 添加不同小鼠血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞形態(tài)

2.2 細胞周期變化

細胞的周期間期是以DNA合成為標志，可分為G1期，S期和G2期。G1期是指DNA合成前期，主要進行細胞體積的增大，并為DNA合成作準備，S期主要是指細胞DNA合成期，染色體數(shù)目在此期加倍，G2期為DNA合成后至細胞分裂開始之前的第二個間期，為細胞分裂作準備。S期是細胞能否增殖的重要階段。

流式細胞儀檢測可見，與空白對照組相比，加入含藥血清后中藥組、西藥組G1期細胞百分比均顯著下降（P＜0.05），S期細胞百分比均顯著增加（P＜0.05），復方組G2期細胞百分比顯著下降、S期細胞百分比顯著增加（P＜0.05），顯示中藥、西藥或復方中的成分可促進細胞增殖。結(jié)果見表1、圖2。

表1 含藥血清對細胞周期變化及細胞凋亡的影響（±s，n=20）

表1 含藥血清對細胞周期變化及細胞凋亡的影響（±s，n=20）

注：與空白對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01

血清類型 不同周期細胞率（%）G1 G2 S空白對照組 52.24±1.95 7.87±1.90 39.90±0.41中藥組 43.18±1.60** 8.73±0.40 48.09±1.37**西藥組 44.66±3.57* 8.71±2.20 46.62±1.39**復方組 46.80±3.57 4.44±0.60* 48.76±2.24**

圖2 含藥血清處理24 h后處于不同周期的細胞百分比

2.3 基因表達變化

ECV-304細胞經(jīng)含藥血清培養(yǎng)基培養(yǎng)后，有多組基因出現(xiàn)表達顯著上調(diào)或下調(diào)。其中，中藥組基因顯著變化（上調(diào)或下調(diào)）有63條，西藥組94條，復方組186條。而可能與高血壓相關(guān)的候選基因顯著變化者，中藥組有18條，西藥組30條、復方組51條。

中藥含藥血清作用于細胞后表達顯著上調(diào)的可能與高血壓相關(guān)的侯選基因有13條，分別為血管活性多肽及其受體（SMO、KLK13、AGTR1），生長因子、細胞因子及受體（CCBP2、IL8、PTX3），鹽敏感基因、轉(zhuǎn)運蛋白及離子通道（ATP7B），細胞增殖、凋亡相關(guān)基因（RRP22、RASSF3），轉(zhuǎn)錄因子、發(fā)育相關(guān)分子（PROSC、ELL2、PBX2），細胞信息傳遞分子（NTRK3）。中藥含藥血清作用細胞后表達顯著下調(diào)的可能與高血壓相關(guān)的侯選基因5條，分別為細胞增殖、凋亡相關(guān)基因（DAP3），應(yīng)激分子及細胞外基質(zhì)（COL8A1），轉(zhuǎn)錄因子、發(fā)育相關(guān)分子（MIER3），脂代謝分子（DPP6），黏附分子及受體（AKAP10）。

西藥含藥血清作用細胞后表達顯著上調(diào)的可能與高血壓相關(guān)的侯選基因16條，分別為生長因子、細胞因子及受體（ECGF1、CCL16、CXCL2、CCL20、IL8、PTX3），細胞增殖、凋亡相關(guān)基因（ANKRD30A、CDCA7、CCAR1、DIDO1），應(yīng)激分子及細胞外基質(zhì)（CRHR1），轉(zhuǎn)錄因子、發(fā)育相關(guān)分子（TRERF1、NFX1、HDAC6），細胞信息傳遞分子（ERN1），脂代謝分子（IDH1）。西藥含藥血清作用細胞后表達顯著下調(diào)的可能與高血壓相關(guān)的侯選基因14條，分別為血管活性多肽及其受體（EDG2），生長因子、細胞因子及受體（RPS6KA6），鹽敏感基因、轉(zhuǎn)運蛋白及離子通道（ATP1A4、GNPTAB），細胞增殖、凋亡相關(guān)基因（CCNG2），應(yīng)激分子及細胞外基質(zhì)（COL8A1），轉(zhuǎn)錄因子、發(fā)育相關(guān)分子（ATF7、MESDC2、GATS、MIER3），細胞信息傳遞分子（SLC7A3、ADRA1A），脂代謝分子（DPP6），黏附分子及受體（PCDH9）。

復方含藥血清作用細胞后表達顯著上調(diào)的可能與高血壓相關(guān)的侯選基因46條，分別為血管活性多肽及其受體（SMO、KLK13、AGTR1），生長因子、細胞因子及受體（CCBP2、IL8、PTX3、TGFBR1、IRAK1BP1、FGF22、GABRQ、ECGF1、CCL20、CXCL1、GNB2L1、GPR125、CXCL2、CRIM1、CXCL6、FOLR1、SSR4、EGFR），鹽敏感基因、轉(zhuǎn)運蛋白及離子通道（ATP7B、GLYATL1、ATPVOA1、PITPNB、SLC25A37），細胞增殖、凋亡相關(guān)基因（RSU1、PDCD5、BLRC3），轉(zhuǎn)錄因子、發(fā)育相關(guān)分子（HDAC9、TFAP2B、PBX1、CRSP8、TAFIC、SFRS5、NFX1、SFRS4、TFCP2），細胞信息傳遞分子（NTRK3、ARHGDIB），脂代謝分子（IDH1、ZAP70、ELOVL5、PRKAA1、IMMT），粘附分子及受體（ITGB3）。復方含藥血清作用細胞后表達顯著下調(diào)的可能與高血壓相關(guān)的侯選基因5條，分別為生長因子、細胞因子及受體（HSD3B1），鹽敏感基因、轉(zhuǎn)運蛋白及離子通道（LARGE），轉(zhuǎn)錄因子、發(fā)育相關(guān)分子（MIER3），細胞信息傳遞分子（RUNX1，CPEB2）。

經(jīng)對比分析，可能與高血壓相關(guān)的侯選基因中，中藥組和復方組共同表現(xiàn)顯著上調(diào)的基因8條，分別為血管活性多肽及其受體（SMO、KLK13、AGTR1），生長因子、細胞因子及受體（CCBP2、IL8、PTX3），鹽敏感基因、轉(zhuǎn)運蛋白及離子通道（ATP7B），細胞信息傳遞分子（NTRK3），共同表現(xiàn)顯著下調(diào)的基因1條，為發(fā)育相關(guān)分子（MIER3）；西藥組和復方組共同表現(xiàn)顯著上調(diào)的基因7條，分別為生長因子、細胞因子及受體（ECGF1、CXCL2、CCL20、IL8、PTX3），轉(zhuǎn)錄因子、發(fā)育相關(guān)分子（NFX1），脂代謝分子（IDH1），共同表現(xiàn)顯著下調(diào)的基因1條，為發(fā)育相關(guān)分子（MIER3）；中藥組、西藥組和復方組共同表現(xiàn)顯著上調(diào)的基因2條，為生長因子、細胞因子及受體（PTX3、IL8），共同表現(xiàn)顯著下調(diào)的基因1條，為發(fā)育相關(guān)分子（MIER3）。

3 討論

珍菊降壓片及其組方中中藥和西藥部分以2.8倍臨床使用劑量連續(xù)7 d口服給藥，其小鼠血清對ECV-304細胞無明顯毒性作用，但可促進其增殖。從基因表達變化可見，中藥組、西藥組及復方組表現(xiàn)出多靶點的作用特點。中藥組、西藥組、復方組有著相同的和不同的基因表達變化，其中有一些可能與高血壓發(fā)生發(fā)展的各種因素密切相關(guān)，包括與脂代謝、血管活性多肽及其受體、鹽敏感基因、轉(zhuǎn)運蛋白及離子通道、生長因子、細胞因子及受體、細胞信息傳遞分子等相關(guān)的基因表達變化，從中顯示了其治療高血壓的活性靶點及作用機理。復方組表現(xiàn)出不同于中藥組、西藥組的作用靶點，復方組上調(diào)基因個數(shù)大于中藥組、西藥組各自上調(diào)基因之和，復方組下調(diào)基因個數(shù)小于中藥組、西藥組分別下調(diào)基因之和，提示處方中中西藥物配伍后發(fā)揮出不同于單獨使用中藥、西藥的作用。

本研究對珍菊降壓片中西藥物配伍后對ECV-304人臍靜脈內(nèi)皮細胞可能與高血壓相關(guān)的候選基因的表達變化作了初探，隨著高血壓相關(guān)基因研究的不斷深入，將對珍菊降壓片中西藥配伍后對高血壓相關(guān)基因的表達進行進一步更深入地研究。

[1] 吳躍進，黃湘.中西藥復方降壓藥珍菊降壓片的研究與應(yīng)用概況[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志，2005，11（3）：238-241.

[2] 黃琳紅，袁秉祥，賀建宇，等.珍菊降壓片對腎性高血壓大鼠血壓的影響[J].西安交通大學學報（醫(yī)學版），2003，24（6）：615-617.

[3] 左錚云，盧毓雄，呂愛平.應(yīng)加強中西藥配伍的基礎(chǔ)研究[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志，2005，11（11）：861-862.