肖長(zhǎng)杰 張 麗 閆利勇 李俊福 陳岱韻 李 紓

(1．泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院口腔科，山東 泰安 271000；2．泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，山東 泰安 271000；3．山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南，250012)

成釉器是來源于口腔外胚層衍化的上皮性組織，在釉質(zhì)形成的過程中起到重要的作用。中間層是牙胚成釉器發(fā)育到鐘狀期而分化出的一種精細(xì)上皮性結(jié)構(gòu)，緊鄰內(nèi)釉上皮，在釉質(zhì)形成過程中這種精細(xì)的上皮性結(jié)構(gòu)經(jīng)歷了顯著的增生和退化過程后逐漸消失, 存在時(shí)間短暫。早在五十年代國(guó)外即有學(xué)者開始關(guān)注中間層細(xì)胞在牙齒發(fā)育中的作用[1]。本實(shí)驗(yàn)選用BALB/c鼠磨牙胚早期發(fā)育建立中間層發(fā)育的模型，經(jīng)HE染色,電鏡超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察, 對(duì)釉質(zhì)正常形態(tài)的建立提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

不同發(fā)育期SPF 級(jí)BALB/C 小鼠(山東大學(xué)動(dòng)物中心提供) ;L EICA RM2135 切片機(jī)(德國(guó));OLYMPUS CX71 顯微鏡及數(shù)碼成像系統(tǒng)(日本);JEM-1200EX透射電鏡(日本)。

1.2 動(dòng)物的選取及標(biāo)本制備

隔天取出生后1～30天的BALB/C小鼠，拉頸處死，分離解剖含下頜第一磨牙區(qū)的下頜骨，新鮮配制4%多聚甲醛固定過夜。自出生后5天的各標(biāo)本分別用甲酸-甲酸鈉復(fù)合脫鈣液脫鈣，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，近遠(yuǎn)中向5 um連續(xù)切片。

1.3 電鏡觀察

將分離的含下頜第一磨牙區(qū)的下頜骨于2.5%戊二醛固定液4℃下初固定48h，10%EDTA脫鈣2周，1%鋨酸后固定2小時(shí)，經(jīng)梯度乙醇脫水后，換置環(huán)氧乙烷過渡。環(huán)氧乙烷:包埋劑=3∶1 1∶1 1∶3及純包埋劑浸透，逐步過渡到Spurr包埋劑中包埋，然后升溫聚合、修塊切片。

2 結(jié) 果

2.1釉質(zhì)分化及分泌期小鼠牙胚中間層發(fā)育過程的組織學(xué)觀察

出生后1d，內(nèi)釉上皮分化為高柱狀的成釉細(xì)胞，緊鄰成釉細(xì)胞的中間層結(jié)構(gòu)清楚，由1-2層細(xì)胞組成，細(xì)胞之間連接緊密(圖1)。出生后5到9天，成釉細(xì)胞呈高柱狀，可見大量釉質(zhì)和牙本質(zhì)的分泌；中間層呈明顯的單細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞排列緊密，與周圍組織的界限清楚(圖2)。出生后13天，成釉細(xì)胞繼續(xù)分泌，成釉細(xì)胞高度降低；中間層細(xì)胞呈單細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞排列較前疏松，中間層細(xì)胞結(jié)構(gòu)、與周圍界限逐漸模糊(圖3)。出生后15天 ，釉質(zhì)分泌基本完成，牙齒部分萌出，中間層結(jié)構(gòu)不易辨認(rèn)(圖4)。

2.2釉質(zhì)分化及分泌期小鼠牙胚中間層發(fā)育電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察

出生后1天細(xì)胞處于分化期，中間層呈多層結(jié)構(gòu)，細(xì)胞扁平狀。內(nèi)釉上皮細(xì)胞極化不明顯，核大胞漿少(圖5)。內(nèi)釉上皮細(xì)胞中核分裂象多見，成釉細(xì)胞極化不明顯.可見中間層胞質(zhì)突起并通過橋粒連接與周圍細(xì)胞相聯(lián)系(圖6)。中間層及成釉細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器成分明顯增多，可見大量的線粒體結(jié)構(gòu)，呈卵圓形，隨釉質(zhì)的礦化，可變得彎曲延長(zhǎng)，胞漿內(nèi)含有大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基復(fù)合體(圖7、圖8)。

圖1 出生后3d，內(nèi)釉上皮分化為高柱狀的成釉細(xì)胞，緊鄰成釉細(xì)胞的中間層結(jié)構(gòu)清楚，由1-2層細(xì)胞組成，細(xì)胞之間連接緊密(HE, 20)。

圖2 出生后5到9 天，成釉細(xì)胞呈高柱狀，可見大量釉質(zhì)和牙本質(zhì)的分泌；中間層呈明顯的單細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞排列緊密，與周圍組織的界限清楚(HE, 20)。

圖3 出生后13天，中間層細(xì)胞呈單細(xì)胞層結(jié)構(gòu)，細(xì)胞排列較前疏松。(HE, 20)。

圖4 出生后15d ，釉質(zhì)分泌基本完成，牙齒部分萌出，中間層結(jié)構(gòu)辨認(rèn)不易(HE, 20)。

圖5 出生后1天中間層呈多層結(jié)構(gòu)，細(xì)胞呈扁平狀。內(nèi)釉上皮細(xì)胞極化不明顯，核大胞漿少(EM, 3000)。

圖6 出生后5-9天成釉細(xì)胞極化明顯，中間層變?yōu)閱螌咏Y(jié)構(gòu)，細(xì)胞間隙變大(EM，3000)。

圖7 出生后5-9天，成釉細(xì)胞和中間層聯(lián)系緊密，細(xì)胞伸出長(zhǎng)的突起，彼此間的橋粒連接明顯增多(EM, 25k)。

圖8 出生后5-9天，釉質(zhì)分泌活躍期，成釉細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器成分明顯增多，可見大量的卵圓形的線粒體結(jié)構(gòu), 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體亦常見(EM, 25k)。

3 討 論

牙胚發(fā)育始于牙板的建立，隨后牙板上皮增厚并向其下方的間充質(zhì)折入,末端膨大并誘導(dǎo)周圍的間充質(zhì)組織細(xì)胞增生、聚集,形成成釉器[2]。成釉器根據(jù)細(xì)胞分化的程度可分為三期：蕾狀期、帽狀期和鐘狀期。到鐘狀期時(shí)牙胚已分化出明顯的四層結(jié)構(gòu)：外釉上皮、內(nèi)釉上皮、星網(wǎng)狀層以及2～3層緊鄰內(nèi)釉上皮的鱗狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)-中間層組織。Koyama等[3]對(duì)胚胎期小牛牙胚發(fā)現(xiàn)帽狀期牙胚尖端部比較明顯的釉結(jié)結(jié)構(gòu)消失，取而代之的是2-3層的中間層結(jié)構(gòu)，并將內(nèi)釉上皮和廣泛的星網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)分開，并指出這種多細(xì)胞層的中間層組織在牙尖部及近尖端1/2的側(cè)緣可以較明顯的觀察到，而在近牙胚頸部處比較薄弱，甚至缺失而不被觀測(cè)到，即在牙胚頸部的內(nèi)釉上皮和星網(wǎng)狀層之間觀測(cè)不到明顯的中間層結(jié)構(gòu)。這與我們實(shí)驗(yàn)中觀察到的結(jié)果基本吻合。對(duì)出生后早期的牙胚光鏡觀察，在靠近牙胚牙尖部中間層為2-3層細(xì)胞組成的條帶結(jié)構(gòu)，胞核明顯，呈橢圓形，而愈靠近側(cè)緣頸部細(xì)胞層次愈薄弱，其外周為疏松的星網(wǎng)狀層，內(nèi)釉上皮呈柱狀或高柱狀，釉牙本質(zhì)界限清楚。

中間層是牙胚發(fā)育整體中的一部分，但是有關(guān)其生物學(xué)特性和可能的功能尚不清楚。有研究表明中間層最初是作為一種多層次的上皮性組織在近釉結(jié)退化的位置逐漸出現(xiàn)。當(dāng)釉結(jié)最終消失后，中間層在幾乎全部占據(jù)其的位置上出現(xiàn)。在牙齒發(fā)生過程中，中間層在組織學(xué)及形態(tài)學(xué)上經(jīng)歷了一個(gè)暫時(shí)的變化過程。中間層的建立及其隨后的一系列生物學(xué)行為都與釉結(jié)內(nèi)及內(nèi)釉上皮內(nèi)的細(xì)胞分化有一定的相關(guān)性。中間層在牙齒從尖端至牙頸部發(fā)育過程中起到一定的導(dǎo)向作用，目前這種功能的具體機(jī)制尚不清楚。據(jù)此學(xué)者們間接推測(cè)中間層可能是繼釉結(jié)之后的又一重要結(jié)構(gòu),細(xì)胞經(jīng)歷了顯著的增生和退化過程,并隨著成釉細(xì)胞分化程度的改變而改變。雖存在時(shí)間短暫，但在一定程度上對(duì)內(nèi)釉上皮/成釉細(xì)胞的分化起到一定的誘導(dǎo)作用。

在實(shí)驗(yàn)中我們觀察到前成釉細(xì)胞核內(nèi)分裂相多見，細(xì)胞器成分比較少，而在釉質(zhì)分泌期細(xì)胞器成分明顯增多。早期牙尖部中間層細(xì)胞在內(nèi)釉上皮和星網(wǎng)狀層之間由2-3層扁平細(xì)胞組成，細(xì)胞器數(shù)量不多。到釉質(zhì)分泌期，細(xì)胞間隙增大充滿微絨毛，細(xì)胞器增多，細(xì)胞突起之間的橋粒連接明顯增多，這種連接可以封閉上皮細(xì)胞的間隙，防止細(xì)胞外物質(zhì)無選擇的進(jìn)入組織，保證物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的方向性，起到機(jī)械支持的作用。這種變化與成釉細(xì)胞的分化及釉基質(zhì)的分泌有一定的相關(guān)性。中間層細(xì)胞可能參與了細(xì)胞與細(xì)胞之間的信息、營(yíng)養(yǎng)傳遞，是成釉細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)備及運(yùn)輸細(xì)胞，在釉質(zhì)形成過程中二者可視為一個(gè)功能統(tǒng)一體。中間層可能為釉質(zhì)形成提供了一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及礦化所需的鈣、磷等物質(zhì)。外釉上皮一開始是比較光滑的組織面，隨之基底膜凹陷并呈多皺褶狀。細(xì)胞間通過較多的橋粒及間隙連接。學(xué)者推測(cè)中間層-外釉上皮-成釉細(xì)胞層作為平行分化的結(jié)構(gòu)，其形態(tài)上及時(shí)空的變化證明三者之間具有分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)及支持的功能[4]。

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[3] Koyama E, Wu C, Shimo T, et al. Development of stratum intermedium and its role as a Sonic hedgehog-signaling structure during odontogenesis[J]. Dev Dyn,2001, 222(2):178-191.

[4] Matthiessen ME, Romert P .Ultrastructure of the human enamel organ. I. External enamel epithelium, stellate reticulum, and stratum intermedium[J].Cell Tissue Res,1980, 205(3): 361-370.