張 玲 王慶才

(泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,山東 泰安 271000)

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)[1]是TNF家族中誘導(dǎo)凋亡的分子之一,TRAIL通過與其特異性膜受體結(jié)合而誘導(dǎo)凋亡?其受體DR4、DR5在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)[2，3]研究發(fā)現(xiàn) TRAIL能夠選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。凋亡相關(guān)新基因PDCD5(TFAR19)[4], 是由北京大學(xué)人類疾病基因中心于1999年在國(guó)際上首先報(bào)道的一個(gè)人類新基因,較多證據(jù)表明PDCD5在腫瘤組織的表達(dá)低于正常組織[5]。

本研究進(jìn)一步探討PDCD5 和TRAIL分別及聯(lián)合對(duì)胃癌細(xì)胞株MKN28細(xì)胞體外誘導(dǎo)凋亡的影響?為胃癌的治療提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人胃癌細(xì)胞MKN28細(xì)胞購(gòu)于第四軍醫(yī)大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在5%C02～37 ℃飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，一般3～4天用0.25%胰酶消化傳代一次?

1.2 試劑

人可溶性PDCD5蛋白購(gòu)于北京人類疾病與基因研究中心； TRAIL購(gòu)于美國(guó) peprotech公司；Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于廣州長(zhǎng)瑞生物技術(shù)有限公司；兔SP檢測(cè)試劑盒購(gòu)于中杉金橋；MTT購(gòu)于Sigma公司。

1.3 藥液的制備及分組

將人可溶性TRAIL及PDCD5蛋白稀釋到所需濃度，TRAIL聯(lián)合PDCD5組為PDCD5各組劑量給藥外,每孔另加TRAIL蛋白200ng/ml(亞濃度),同時(shí)設(shè)置對(duì)照組

1.4 MTT實(shí)驗(yàn)

取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌細(xì)胞株MKN28細(xì)胞，按照實(shí)驗(yàn)步驟用酶標(biāo)儀在490nm處測(cè)定細(xì)胞OD值，計(jì)算抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD)×100%，形態(tài)學(xué)觀察用不同濃度的PDCD5和 TRAIL處理人胃癌細(xì)胞株MKN28在倒置顯微鏡下形態(tài)變化,并攝影

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將各濃度的PDCD5和 TRAIL分別加入培養(yǎng)細(xì)胞至預(yù)定時(shí)間后,按照實(shí)驗(yàn)步驟消化，吹打，收集待測(cè)細(xì)胞,細(xì)胞懸液，加入10Annexin V-FITC和5～10碘化丙啶,，孵育后，加入400ml1倍結(jié)合緩沖液后上機(jī)檢測(cè)，利用流式細(xì)胞儀488 nm波長(zhǎng)分析凋亡細(xì)胞，并設(shè)定PBS組對(duì)照

1.6 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞DNA含量

PDCD5和TRAIL蛋白處理過的MKN28細(xì)胞及對(duì)照組至預(yù)定時(shí)間后，依實(shí)驗(yàn)要求上機(jī)檢測(cè),用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞DNA結(jié)合PI的熒光強(qiáng)度,分析DNA含量和細(xì)胞周期。

1.7 AO/EB雙染色

分別收集經(jīng)PDCD5和TRAIL蛋白處理至預(yù)定時(shí)間的MKN28細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞, 制備單細(xì)胞懸液, 加入AO和EB后顯微鏡直接觀察,熒光顯微鏡510 nm激發(fā)波長(zhǎng)觀察。

2 結(jié) 果

2.1 倒置顯微鏡觀察治療前后各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

治療前，胃癌MKN28細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，生長(zhǎng)旺盛，治療后細(xì)胞部分變圓浮起，細(xì)胞間接觸變松，間距增寬，增殖變慢，細(xì)胞中顆粒增多，細(xì)胞周圍出現(xiàn)碎片。而且隨著PDCD5和TRAIL蛋白濃度的升高，這種變化越發(fā)明顯。在PDCD5聯(lián)合TRAIL組最大濃度組中，70-80%的細(xì)胞變圓浮起，出現(xiàn)大量碎片。對(duì)照組變化不明顯。(圖1)

圖1 200ng/ml TRAIL+20ug/mlPDCD5作用后的MKN28細(xì)胞

2.2 AO/EB雙染色結(jié)果

AO/EB染色及熒光顯微鏡觀察:不同濃度的TRAIL作用MKN28細(xì)胞后后，早期凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞體積縮小，胞核呈黃綠色，致密固縮濃染或碎片狀，胞膜尚完整，胞質(zhì)桔紅色；而晚期凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為，染色質(zhì)被EB染成橙色呈固縮狀或圓珠狀；壞死細(xì)胞核染色質(zhì)也被EB染成橙色或紅色，但細(xì)胞核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)尚正常?？瞻讓?duì)照組未經(jīng)TRAIL處理的正?；罴?xì)胞核呈圓形，核染色質(zhì)被AO染成均勻一致的綠色或黃綠色，核染色質(zhì)呈正常結(jié)構(gòu)。(圖2)

圖2 200ng/mlTRAIL+20ug/mlPDCD5作用后MKN28細(xì)胞

2.3 MTT細(xì)胞增殖活性結(jié)果

PDCD5作用于胃癌MKN28細(xì)胞，對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制作用不明顯，隨著PDCD5蛋白濃度的升高對(duì)細(xì)胞的抑制率并不呈梯度增長(zhǎng)的趨勢(shì)，不具有劑量依賴性。與空白對(duì)照組差異不明顯，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；TRAIL蛋白作用于胃癌MKN28細(xì)胞，抑制率具有劑量依賴性(表1)；PDCD5聯(lián)合TRAIL組對(duì)胃癌MKN28細(xì)胞的抑制率最高(表2)； TRAIL蛋白治療組與空白對(duì)照組、PDCD5組、PDCD5聯(lián)合TRAIL組相比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 不同濃度不同時(shí)間TRAIL蛋白(ng/ml)作用胃癌MKN28細(xì)胞的抑制率

表2 PDCD5(ug/ml)聯(lián)合TRAIL( ng/ml)蛋白在不同的時(shí)間作用于胃癌MKN28細(xì)胞的抑制率

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率結(jié)果

流式細(xì)胞儀檢測(cè)PDCD5單獨(dú)作用于MKN28細(xì)胞未顯示凋亡細(xì)胞群，經(jīng)不同濃度TRAIL處理MKN28細(xì)胞，其凋亡率隨著濃度的增高而升高，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 各組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TRAIL聯(lián)合PDCD5作用于細(xì)胞凋亡率顯著增加，并具有劑量依賴性。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)DNA含量及細(xì)胞周期結(jié)果

MKN28細(xì)胞經(jīng)TRAIL，TRAIL聯(lián)合PDCD5作用后，細(xì)胞被阻滯于G0/G1，S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)明顯減少，細(xì)胞分裂受到抑制，凋亡率增加，DNA含量圖可見，在DNA細(xì)胞周期峰前有一個(gè)亞二倍體峰，經(jīng)凋亡程序軟件分析，確認(rèn)為凋亡峰。(圖1～4)

圖1 50ng/ml TRAIL作用于MKN28細(xì)胞的凋亡率(Annexin V)

圖2 50ng/ml TRAIL作用于MKN28細(xì)胞的凋亡率(DNA含量)

圖3 200ng/ml TRAIL+ 40ug/mlPDCD5作用后細(xì)胞的凋亡率(Annexin V )

圖4 200ng/ml TRAIL+ 40ug/mlPDCD5作用后MKN28細(xì)胞的凋亡率(DNA含量)

3 討論

胃癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一,死亡率在惡性腫瘤中名列前茅。胃癌的發(fā)生與胃粘膜上皮細(xì)胞和胃癌細(xì)胞凋亡、增殖調(diào)控失衡有關(guān)?；蛲蛔兓蚧虮磉_(dá)失常是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵[6]。對(duì)凋亡相關(guān)基因及其表達(dá)產(chǎn)物與腫瘤關(guān)系的深入研究，在揭示腫瘤的發(fā)病機(jī)制、早期診斷、預(yù)防及治療腫瘤方面均具有重要意義。

PDCD5及TRAIL均是近年新發(fā)現(xiàn)的凋亡相關(guān)基因。腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體或凋亡素2配體是TNF家庭的新成員。TRAIL與新近發(fā)現(xiàn)的受體相結(jié)合啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，具有大量、快速誘導(dǎo)凋亡的作用并且僅誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，而正常組織細(xì)胞卻對(duì)其不敏感，提示TRAIL在腫瘤治療方面具有廣闊的前景。PDCD5基因是人類新基因，參與細(xì)胞凋亡調(diào)控過程, 是一個(gè)表達(dá)廣泛、進(jìn)化保守的重要凋亡正調(diào)控基因，在多種腫瘤和白血病中表達(dá)下調(diào)，具有臨床檢測(cè)價(jià)值，并有可能作為腫瘤的凋亡促進(jìn)劑應(yīng)用于臨床現(xiàn)研究證實(shí).PDCD5和TRAIL在胃癌中的研究報(bào)道不多,兩者聯(lián)合檢測(cè)實(shí)驗(yàn)更具有臨床指導(dǎo)價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PDCD5作用于胃癌MKN28細(xì)胞，其抑制作用不明顯，說明PDCD5蛋白質(zhì)是TF-1細(xì)胞凋亡早期過程發(fā)揮作用的、凋亡相關(guān)基因所表達(dá)的凋亡相關(guān)蛋白。PDCD5蛋白為凋亡促進(jìn)劑而非誘導(dǎo)劑[7]，對(duì)細(xì)胞生物學(xué)特性影響較小，單獨(dú)使用對(duì)細(xì)胞無毒性作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)表明，不同濃度的TRAIL均能抑制胃癌MKN28細(xì)胞細(xì)胞的增殖活性，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制呈時(shí)間和劑量依賴性。可以判斷TRAIL在體外對(duì)胃癌MKN28細(xì)胞具有殺傷作用，可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。PDCD5聯(lián)合TRAIL作用于 MKN28細(xì)胞進(jìn)一步揭示了PDCD5與TRAIL協(xié)同作用的機(jī)制。此機(jī)制是提高了TRAIL對(duì)腫瘤細(xì)胞的敏感性，也就是與其死亡受體DR4, DR5mRNA的上調(diào)有關(guān)[8-9]。

總之，本實(shí)驗(yàn)對(duì)調(diào)亡相關(guān)基因的研究為胃癌的診斷及治療提供了新的思路。為胃癌治療的成功提供了科學(xué)依據(jù)，并且為發(fā)掘新的抗癌藥物拓寬研究領(lǐng)域。但是，尚有許多問題需進(jìn)一步闡明，如本實(shí)驗(yàn)的研究表明PDCD5在胃癌組織中的表達(dá)的規(guī)律， PDCD5在細(xì)胞凋亡過程中提高TRAIL對(duì)腫瘤細(xì)胞的敏感性的機(jī)制。細(xì)胞內(nèi)還有哪些分子和PDCD5結(jié)合共同調(diào)控細(xì)胞的凋亡？以上問題尚待進(jìn)一步研究闡明，也將為腫瘤及其它與凋亡調(diào)控異常相關(guān)疾病的病因全面揭示提供重要線索。

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