萬(wàn)光勇 張明賓

(泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院口腔科，山東 泰安 271000)

近年來(lái)，隨著材料學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，利用組織工程學(xué)原理與方法再生組織、甚至器官的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)得到廣泛認(rèn)同，而骨組織工程則是目前公認(rèn)的最有可能在臨床取得實(shí)際效益的研究領(lǐng)域之一。組織工程技術(shù)的發(fā)展迅速，為骨缺損治療提供了新的前景。組織工程化骨的構(gòu)建涉及三個(gè)重要因素，即種子細(xì)胞、生物支架、構(gòu)建方法。在種子細(xì)胞細(xì)胞的研究方面，脂肪干細(xì)胞(ADSCs)目前是研究的熱點(diǎn)[1-4]。骨組織工程中，體外將種子細(xì)胞和材料復(fù)合是組織工程體內(nèi)構(gòu)建的必經(jīng)環(huán)節(jié)，體外培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞的粘附生長(zhǎng)狀況將影響體內(nèi)成骨的效果，觀察體外培養(yǎng)過(guò)程是分析成骨過(guò)程中諸因素作用的不可缺少的方面，因此，需要有效的觀測(cè)手段研究細(xì)胞在支架上的生長(zhǎng)規(guī)律。本研究利用熒光活性染料DiO對(duì)人脂肪干細(xì)胞(hADSCs)進(jìn)行染色標(biāo)記，采用激光共聚焦顯微鏡觀察了hADSCs在部分脫鈣骨上(PDBM)的生長(zhǎng)及粘附情況，取得了滿意的觀測(cè)效果。

1 材料與方法

1.1材料 部分脫鈣骨：由上海組織工程中心提供(圖1)。人脂肪干細(xì)胞：由脂肪抽吸組織中分離、培養(yǎng)[5]。3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate(DiO) Mol Probes公司(美國(guó))。地塞米松、β-磷酸甘油、2-磷酸抗壞血酸購(gòu)自Sigma公司。LSM-510激光共聚焦掃描顯微鏡：ZEISS公司(德國(guó))。

1.2方法

1.2.1hADSCs的分離、培養(yǎng) 將脂肪抽吸物在無(wú)菌條件下裝入175 cm2培養(yǎng)瓶中，帶回實(shí)驗(yàn)室，時(shí)間不超過(guò)2小時(shí)h。用無(wú)菌的PBS反復(fù)沖洗至抽吸物溶液變清，以去除血細(xì)胞、碳酸氫鈉、局麻藥。加入等體積0.1%Ⅰ型膠原酶，在37℃恒溫?fù)u床消化1 h，1200 rpm離心10 min，獲得高密度的細(xì)胞沉淀物，輕輕傾去上清液和漂浮的黃色組織，將細(xì)胞振蕩混勻，加入DMEM+10%FBS培養(yǎng)液使細(xì)胞重懸。吸取少量細(xì)胞懸液用4%乙酸等體積稀釋破壞紅細(xì)胞，血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀常規(guī)計(jì)數(shù)有核細(xì)胞數(shù)，按4×105有核細(xì)胞/cm2細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，常用的100 mm塑料培養(yǎng)皿接種細(xì)胞 3×107左右，加入培養(yǎng)液8ml。將接種好細(xì)胞的培養(yǎng)皿置于37 ℃、5%CO2、100%飽和濕度的條件下，培養(yǎng)24 h后首次換液。倒置相差顯微鏡下觀察有大量細(xì)胞貼壁和漂浮的血細(xì)胞，用PBS反復(fù)沖洗去除漂浮的細(xì)胞，加入DMEM+10%FBS培養(yǎng)液。每周換液2次，細(xì)胞融合至80%傳代。傳代前用少量PBS洗滌一次，加入0.25% 胰蛋白酶和0.02% EDTA 2 ml,見大部分細(xì)胞胞質(zhì)回縮、形態(tài)變圓，加入2 ml含血清的DMEM培養(yǎng)液中止消化，收集細(xì)胞懸液、計(jì)數(shù)，以2×104/cm2細(xì)胞密度接種于新的培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)液用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(10%FBS基礎(chǔ)培養(yǎng)液加入1 nmol/L地塞米松，2.16 g/Lβ-甘油磷酸鈉，37.5 g/L 2-磷酸-抗壞血酸)。本研究選用第二代hADSCs。

1.2.2掃描電鏡觀察細(xì)胞材料復(fù)合物

1) hADSCs 與部分脫鈣骨體外復(fù)合 將部分脫鈣骨修剪成5 mm×5 mm×3 mm大小，鈷60照射滅菌 ，將第二代hADSCs懸液按3×107/ml接種于部分脫鈣骨材料上，采用將接種的細(xì)胞懸液反復(fù)滴加的方法，使接種細(xì)胞均勻地分布于材料上，將細(xì)胞材料復(fù)合物放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，待接種細(xì)胞已粘附于材料上后，加入10%DMEM誘導(dǎo)培養(yǎng)液，隔天換液一次，并在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

2) 掃描電鏡觀察：第7天時(shí)，將細(xì)胞材料復(fù)合物取出，PBS輕輕沖洗，在2%的戊二醛中固定30 min；PBS漂洗3次；1%OsO4固定45 min；PBS漂洗3次；脫水：丙酮/醋酸異戊脂(1：1)10 min；醋酸異戊脂30 min ；臨界點(diǎn)干燥；噴金；掃描電鏡觀察、照相，同時(shí)也行橫斷面掃描電鏡觀察、照相。

1.2.3hADSCs在部分脫鈣骨上粘附率的測(cè)定 根據(jù)Kasten報(bào)道的方法[6]，做了部分改進(jìn)。將部分脫鈣骨修剪成5 mm×5 mm×3 mm大小，鈷60照射滅菌 ，將第2代hADSCs按5×105/0.1 ml/塊的濃度接種于部分脫鈣骨支架上，共9塊，采用將接種的細(xì)胞懸液反復(fù)滴加的方法，使接種細(xì)胞均勻地分布于材料上，將細(xì)胞支架復(fù)合物于37 ℃﹑5%二氧化碳培養(yǎng)箱中放置4 h后，換于另一平皿，加入培養(yǎng)液，將原平皿中加入0.25%胰酶0.02%EDTA，消化收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，得出流失的細(xì)胞量；細(xì)胞材料復(fù)合物培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞材料復(fù)合物于培養(yǎng)液中輕輕晃動(dòng)，并換入另一培養(yǎng)皿培養(yǎng)，收集原培養(yǎng)皿培養(yǎng)液，加0.25%胰酶0.02%EDTA于原培養(yǎng)皿中消化收集貼壁的細(xì)胞，并與原培養(yǎng)液中細(xì)胞一并計(jì)數(shù)，得出未粘附的細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞粘附率=(接種的細(xì)胞數(shù)-流失的細(xì)胞數(shù)-未粘附的細(xì)胞)/(接種的細(xì)胞數(shù)-流失的細(xì)胞數(shù))。

1.2.4DiO標(biāo)記成骨誘導(dǎo)的hADSCs細(xì)胞平面培養(yǎng)時(shí)單層細(xì)胞生長(zhǎng)觀察 將DiO用無(wú)水乙醇配成2 mg/ml的溶液，按1ul/1×107個(gè)ADSCs的濃度標(biāo)記細(xì)胞；標(biāo)記前，將所需體積的DiO溶液用無(wú)血清的DMEM稀釋250倍，加入第2代ADSCs懸液中，在37 ℃﹑5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育20 min；離心1000轉(zhuǎn)，5 min，棄上清；加入PBS沖洗，離心1000轉(zhuǎn)，5 min，棄上清，重復(fù)1次；加入10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，形成細(xì)胞懸液，臺(tái)盼蘭染色，計(jì)數(shù)。將標(biāo)記的細(xì)胞以3×104/ cm2的濃度接種于培養(yǎng)皿中，觀察細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)。

1.2.5DiO標(biāo)記hADSCs粘附率的測(cè)定 采用與測(cè)定未標(biāo)記的hADSCs粘附率相同的方法檢測(cè)DiO標(biāo)記的第2代hADSCs在部分脫鈣骨上的粘附率，共接種9塊。將DiO標(biāo)記hADSCs粘附率與未標(biāo)記的hADSCs粘附率進(jìn)行比較。

1.2.6激光共聚焦檢測(cè) 細(xì)胞材料復(fù)合物于接種后第1﹑3﹑7天行激光共聚焦顯微鏡觀察,并觀察細(xì)胞在平面培養(yǎng)及支架材料上的生長(zhǎng)情況。

2 結(jié) 果

2.1掃描電鏡觀察 體外培養(yǎng)7d后掃描電鏡觀察hADSCs與部分脫鈣骨體外復(fù)合物，見部分脫鈣骨表面的細(xì)胞粘連成片，將材料表面完全覆蓋，孔隙中也充滿細(xì)胞；細(xì)胞形態(tài)好，呈伸展?fàn)?、多層立體生長(zhǎng)(圖2A)，基質(zhì)分泌豐富。復(fù)合物橫斷面掃描電鏡見材料內(nèi)部孔隙中也充滿細(xì)胞及基質(zhì)(圖2B)。

2.2hADSCs在部分脫鈣骨上粘附率

表1 hADSCs在部分脫鈣骨上粘附率

2.3DiO標(biāo)記hADSCs觀察細(xì)胞材料復(fù)合物中細(xì)胞的粘附生長(zhǎng)

1) DiO標(biāo)記的hADSCs粘附率為(94.5±2.2)%，未標(biāo)記的hADSCs粘附率為(95.1±1.3)%，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩者無(wú)顯著差異(P>0.05)。(圖3)

2)DiO標(biāo)記后，臺(tái)盼藍(lán)染色，見細(xì)胞活力好，僅偶見蘭染細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察，見細(xì)胞標(biāo)記后顯黃綠色熒光(圖4A)，標(biāo)記的hADSCs細(xì)胞呈梭形，保持了良好的形態(tài)，細(xì)胞核未染熒光。

3) DiO標(biāo)記細(xì)胞三維培養(yǎng)生長(zhǎng)狀況 激光共聚焦顯微鏡下觀察，接種后第1d見細(xì)胞粘附于支架材料的實(shí)質(zhì)性部分(圖4B)或在孔的邊緣上呈單層排列，細(xì)胞呈均勻的黃綠色熒光；接種后第3d見細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，孔中細(xì)胞呈多層排列(圖4C)；第7d細(xì)胞覆蓋了大部分的材料表面，融合成片，熒光強(qiáng)度未見減弱，孔中充滿了細(xì)胞(圖4D)。

圖1 部分脫鈣骨呈白色、立體多孔狀結(jié)構(gòu)。

A：大體照片；B：局部放大；C：掃描電鏡部分脫鈣骨表面；D：掃描電鏡橫斷面

圖2 掃描電鏡照片。

A：復(fù)合物表面；B：復(fù)合物斷面

圖3 DiO標(biāo)記及未標(biāo)記hADSCs的粘附率

圖4 共聚焦顯微鏡觀察hADSCs在部分脫鈣骨上生長(zhǎng)情況。 A：DIO標(biāo)記第二代hADSCs，平面培養(yǎng)時(shí)發(fā)出黃綠色熒光； B：DIO標(biāo)記第二代hADSCs，接種后共培養(yǎng)1d；C：共培養(yǎng)3d；D：共培養(yǎng)7d。(×100)

3 討 論

骨組織工程中，體外將種子細(xì)胞和材料復(fù)合是組織工程體內(nèi)構(gòu)建的必經(jīng)環(huán)節(jié)，細(xì)胞在材料上的粘附率是評(píng)價(jià)組織工程支架材料的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了人脂肪干細(xì)胞在部分脫鈣骨上的粘附率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，人脂肪干細(xì)胞能較好地粘附在部分脫鈣骨上，在部分脫鈣骨的表面及內(nèi)部孔隙中都能粘附，并能正常生長(zhǎng)。符合骨組織工程支架材料的基本要求。人脂肪干細(xì)胞與部分脫鈣骨的粘附率為96%，與Kasten[6]的研究結(jié)果相符合，DiO標(biāo)記的hADSCs粘附率為(94.5±2.2)%，未標(biāo)記的hADSCs粘附率為(95.1±1.3)%，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩者無(wú)顯著差異(P>0.05)。這說(shuō)明DIO標(biāo)記hADSCs后，不影響其在部分脫鈣骨上的粘附生長(zhǎng)。

細(xì)胞-支架復(fù)合物的體外培養(yǎng)是構(gòu)建組織工程化骨的一個(gè)重要步驟。體外培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞的粘附生長(zhǎng)狀況將影響體內(nèi)成骨的效果，觀察體外培養(yǎng)過(guò)程是分析成骨過(guò)程中諸因素作用的不可缺少的方面，因此，需要有效的觀測(cè)手段研究細(xì)胞在支架上的生長(zhǎng)規(guī)律。相差顯微鏡是觀察活細(xì)胞常用的方法，用來(lái)觀測(cè)單層培養(yǎng)的細(xì)胞，骨組織工程細(xì)胞支架復(fù)合物厚度一般大于1 mm，多數(shù)支架材料透光性差，光鏡下難以分清細(xì)胞形態(tài)。在本實(shí)驗(yàn)中，將成骨誘導(dǎo)后的脂肪干細(xì)胞接種在部分脫鈣骨上，培養(yǎng)七天后通過(guò)掃描電鏡觀察，見部分脫鈣骨表面的細(xì)胞粘連成片，將材料表面完全覆蓋，孔隙中也充滿細(xì)胞；細(xì)胞形態(tài)好，呈伸展?fàn)?、多層立體生長(zhǎng)，基質(zhì)分泌豐富。復(fù)合物橫斷面掃描電鏡見材料內(nèi)部孔隙中也充滿細(xì)胞及基質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人脂肪干細(xì)胞能較好地粘附在部分脫鈣骨上，在部分脫鈣骨的表面及內(nèi)部孔隙中都能粘附，并能正常生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，部分脫鈣骨對(duì)人脂肪干細(xì)胞有良好的細(xì)胞相容性。

DiO是親脂性熒光染料，易嵌入生物質(zhì)膜內(nèi)并在膜內(nèi)作側(cè)向擴(kuò)散運(yùn)動(dòng),從而標(biāo)記整個(gè)細(xì)胞。DiO無(wú)細(xì)胞毒性，對(duì)被標(biāo)記細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)無(wú)影響，在標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)消失慢。DiO在進(jìn)入細(xì)胞膜之前熒光非常弱，僅當(dāng)進(jìn)入到細(xì)胞膜后才可以被激發(fā)出很強(qiáng)的熒光，DiO被激發(fā)后可以發(fā)出綠色的熒光，本研究證實(shí)DiO能標(biāo)記hADSCs，標(biāo)記的細(xì)胞形態(tài)良好，DiO在hADSCs內(nèi)表達(dá)穩(wěn)定，體外培養(yǎng)7 d內(nèi)未見熒光減弱。標(biāo)記細(xì)胞接種于支架上后，第1天時(shí)，粘附于支架實(shí)質(zhì)的表面，孔的邊緣附著有單層排列的細(xì)胞，孔中無(wú)細(xì)胞。第3天時(shí)，見細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，孔中細(xì)胞呈多層排列。第7天時(shí)，細(xì)胞覆蓋了大部分的材料表面，融合成片，熒光強(qiáng)度未見減弱，孔中充滿了細(xì)胞。在以往的實(shí)驗(yàn)察中，難以觀察到支架實(shí)質(zhì)表面的細(xì)胞分布，僅通過(guò)觀察部分透光的孔中的細(xì)胞分布，往往不能對(duì)細(xì)胞材料復(fù)合物做出及時(shí)﹑正確的判斷。標(biāo)記的細(xì)胞在支架上呈均勻的梭形黃綠色熒光，很少見到未染熒光的細(xì)胞核區(qū)，這與支架表面凹凸不平的細(xì)微結(jié)構(gòu)有關(guān)，細(xì)胞的各部分不是附著在同一平面上，激光共聚焦顯微鏡只能觀察到細(xì)胞的一部分。在7 d體外培養(yǎng)中，DiO標(biāo)記的ADSCs熒光表達(dá)穩(wěn)定，不影響細(xì)胞粘附,能反映細(xì)胞在支架材料上的正常生長(zhǎng)狀況，因此，DiO標(biāo)記是一種簡(jiǎn)潔﹑準(zhǔn)確的觀察ADSCs細(xì)胞在支架材料上狀況的方法。DiO標(biāo)記還用于觀察雞胚和新生小鼠晶狀體纖維細(xì)胞[7]、小鼠的血管內(nèi)皮細(xì)胞[8]、小鼠骨髓來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞[9]、人胎盤的血管內(nèi)皮細(xì)胞[10]、猴虹膜色素上皮細(xì)胞[11]、豬的巨噬細(xì)胞[12]等，均報(bào)道其標(biāo)記效果良好。

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