陳怡然，　吳小華

隨著2002年人類基因組計(jì)劃的完成，以及其他種類生物全基因組圖譜的陸續(xù)描繪，發(fā)現(xiàn)不同種群間的基因差別僅為1%，主要表現(xiàn)為外顯子的差異。外顯子作為蛋白質(zhì)的編碼區(qū)，是DNA中的重要功能序列，其僅占人類基因組約1%[1]，但涵蓋了與個(gè)體表型相關(guān)的大部分功能性變異，與人類約85%的導(dǎo)致疾病的基因突變相關(guān)[2]。全外顯子組(exome)為人類基因組全部外顯子區(qū)域的總稱，全外顯子組測(cè)序(whole-exome sequencing)又稱為定向外顯子組捕獲(targeted exome capture),可選擇性的對(duì)人類基因組的編碼區(qū)進(jìn)行測(cè)序，從而發(fā)現(xiàn)罕見(jiàn)及常見(jiàn)疾病相關(guān)的異?；騕3]。目前，全外顯子組測(cè)序相比于全基因組測(cè)序，其低成本、高效率的優(yōu)勢(shì)日益顯著。在單基因疾病的應(yīng)用中，其不僅加快單基因缺陷疾病的基因確定，在系統(tǒng)地預(yù)測(cè)疾病相關(guān)基因方面亦有應(yīng)用。對(duì)于復(fù)雜疾病如腫瘤、糖尿病等的致病基因和易感基因的測(cè)定等[4]也有相當(dāng)?shù)膽?yīng)用前景。本文主要對(duì)全外顯子組測(cè)序技術(shù)以及目前該技術(shù)在腫瘤研究中的應(yīng)用等問(wèn)題進(jìn)行闡述。

1　全外顯子組測(cè)序技術(shù)

全外顯子組測(cè)序技術(shù)作為一種新型的基因組分析技術(shù)，包括全外顯子組序列捕獲及測(cè)序。

1.1　全外顯子組序列捕獲

以兩種較成熟的方法為例。

1.1.1NimbleGen外顯子序列捕獲芯片法基因組DNA被隨機(jī)打斷成片段，隨后在DNA片段兩端分別連上接頭，與定制的序列捕獲芯片雜交，去除未與芯片結(jié)合的背景DNA，將經(jīng)過(guò)富集的外顯子區(qū)域的DNA洗脫并擴(kuò)增。

1.1.2In-Solution 捕獲法所要求的基因起始量低，能有效地捕獲包含未知突變的DNA。具體步驟[5]：(1)基因組DNA被打斷，并組裝成測(cè)序平臺(tái)特異的文庫(kù)形式。在捕獲之前，對(duì)文庫(kù)的大小進(jìn)行選擇，并利用電泳等方法來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。(2)精選大小的文庫(kù)，隨后與誘餌共同孵育24 h。(3)加入鏈酶親和素標(biāo)記的磁珠，并通過(guò)強(qiáng)磁鐵從混合物中釣出RNA誘餌-DNA雜合體。(4)洗脫磁珠，將RNA誘餌降解，將得到的目的DNA進(jìn)行常規(guī)的擴(kuò)增和測(cè)序。

以上方法主要通過(guò)捕獲芯片或溶液型目標(biāo)富集系統(tǒng)完成。捕獲芯片作為定向測(cè)序的快速有效的方法，更適用于小型化研究，而溶液型則適用于樣品數(shù)量上千的大規(guī)模高通量測(cè)序研究。

1.2　全外顯子組測(cè)序

目前應(yīng)用的主要測(cè)序平臺(tái)有：Roche454，Illumina Genome Analyzer Ⅱ，Applied Biosystems SOLiD。

圖1　In-Solution法捕獲外顯子組流程[5]

1.2.1Roche454即大規(guī)模并行焦磷酸合成測(cè)序法，采用GS FLX系統(tǒng)：每個(gè)磁珠通過(guò)接頭，與一條大小為300～800bp的DNA片段結(jié)合構(gòu)成樣品文庫(kù)。包含磁珠和擴(kuò)增試劑的水溶液注入礦物油中，形成油包水的乳濁液結(jié)構(gòu)，乳濁液PCR在每個(gè)小水滴中獨(dú)立進(jìn)行，產(chǎn)生幾百萬(wàn)相同的拷貝，焦磷酸測(cè)序反應(yīng)測(cè)得每個(gè)磁珠上的片段產(chǎn)生一條讀長(zhǎng)，由此進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[6]。

1.2.2Applied Biosystems SOLiD即基于磁珠的大規(guī)模并行克隆連接DNA測(cè)序法，采用SOLD系統(tǒng)：利用微珠通過(guò)接頭捕獲DNA片段，之后進(jìn)行乳液PCR。其以連接反應(yīng)取代傳統(tǒng)的聚合酶延伸反應(yīng)，以8bp的探針作為連接反應(yīng)的底物，探針設(shè)計(jì)為將3′端1～2位的堿基與5′端標(biāo)記的熒光信號(hào)的顏色相對(duì)應(yīng)。一次SOLiD測(cè)序共為五輪循環(huán)測(cè)序，每輪由多個(gè)連接反應(yīng)組成。五輪測(cè)序完成后，可得到各位置的顏色信息，從而推斷出相應(yīng)的堿基序列[7]。

1.2.3Illum ina Genome Analyzer Ⅱ即合成測(cè)序法，采用GA Ⅱ系統(tǒng)。單鏈的DNA片段兩端通過(guò)接通固定到芯片表面，形成橋結(jié)構(gòu)，之后以寡核苷酸為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到單克隆DNA族群。測(cè)序中，利用“可逆終止子”，使得每個(gè)測(cè)序循環(huán)只摻入單個(gè)堿基，獲得各位置單個(gè)堿基的信息后，將反應(yīng)試劑洗脫，加入新的反應(yīng)體系，開始下一測(cè)序循環(huán)[8]。

新一代的測(cè)序平臺(tái)，與傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)相比，利用接頭構(gòu)建基因文庫(kù)，在反應(yīng)基質(zhì)上進(jìn)行大規(guī)模的并行PCR，實(shí)現(xiàn)了邊合成邊測(cè)序的可能性。

不可否認(rèn)的是，全外顯子測(cè)序技術(shù)作為一種新型技術(shù)，目前其對(duì)于全基因組蛋白質(zhì)編碼區(qū)的覆蓋并不如設(shè)計(jì)的理想，Jacobs等[9]評(píng)估后發(fā)現(xiàn)，NimbleGen的捕獲探針捕獲蛋白質(zhì)編碼序列堿基率為77%，Agilent為83%，并且不同方法的測(cè)序亦均有一定程度的缺失。故目前對(duì)于該新型技術(shù)的應(yīng)用，尤其是對(duì)于實(shí)驗(yàn)陰性結(jié)果的解釋，仍需謹(jǐn)慎為之。

2　全外顯子組測(cè)序技術(shù)在腫瘤學(xué)方面的應(yīng)用現(xiàn)狀

2.1　找尋潛在癌基因及抑癌基因，為腫瘤的分子診斷提供參考

全外顯子組測(cè)序技術(shù)由于對(duì)外顯子的高覆蓋而獲得大量的基因樣本。故即使在樣本中腫瘤細(xì)胞含量較少和(或)樣本純度差異較大的情況下，其仍可較好的對(duì)外顯子區(qū)域的基因突變進(jìn)行測(cè)定，從而進(jìn)一步確定腫瘤相關(guān)癌基因及抑癌基因，為腫瘤的早期診斷提供依據(jù)[10]。

Wei等[11]對(duì)14位配對(duì)的正常人及轉(zhuǎn)移黑素瘤患者進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)TRRAP頻發(fā)突變具有致癌功能；患者GRIN2A突變頻率達(dá)33%；突變均發(fā)生在谷氨酸信號(hào)通路的編碼區(qū)域，通過(guò)該信號(hào)通路的修飾達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)成為潛在的治療手段。類似地，Varela等[12]在對(duì)7例腎透明細(xì)胞癌患者的研究中，發(fā)現(xiàn)SWI/SNF染色質(zhì)重組復(fù)合體基因PBRM1作為該腫瘤的第二大癌基因，在患者組截?cái)嗤蛔兟蔬_(dá)41%。Jones等[13]通過(guò)對(duì)42例卵巢透明細(xì)胞癌患者的腫瘤和正常細(xì)胞的對(duì)比分析，篩選得到4個(gè)基因，PIK3CA編碼磷脂酰肌醇-3激酶亞單位，KRAS與已知癌基因產(chǎn)物相關(guān)。PPP2R1A編碼絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶2的調(diào)控亞單位，功能類似癌基因。ARID1A作為腫瘤抑制基因編碼產(chǎn)物參與染色體重構(gòu)，并且其在42例患者中突變率達(dá)到57%。Parsons等[14]在兒童髓母細(xì)胞瘤的研究中，發(fā)現(xiàn)16%的髓母細(xì)胞瘤的患者中存在著組蛋白-賴氨酸-N甲基轉(zhuǎn)移酶基因MLL2或MLL3的鈍化突變。該研究同時(shí)揭示了兒童及成人髓母細(xì)胞瘤的遺傳景觀上的關(guān)鍵差異。

相比于散發(fā)而言，家族性腫瘤的遺傳傾向常更明顯，故全面的、無(wú)偏倚的蛋白質(zhì)編碼區(qū)的基因測(cè)序成為確定相關(guān)責(zé)任基因的一種可行方法。Jones等[15]對(duì)家族性胰腺癌進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)該家系的3個(gè)獨(dú)立的截?cái)嗤蛔?，確立了PALB2為家族性胰腺癌的易感基因。Goldin等[16]在對(duì)腫瘤易感家族的研究中，對(duì)3個(gè)黑色素瘤及2個(gè)霍杰金淋巴瘤的家族以及各家族1名遠(yuǎn)親對(duì)比進(jìn)行全外顯子組的測(cè)序，發(fā)現(xiàn)每個(gè)家族可以獲得0～100不等的候選非同義突變。通過(guò)追蹤，對(duì)各家族其他成員進(jìn)行基因分析，使得篩選該腫瘤的家族易感基因成為可能。

2.2　協(xié)助腫瘤分型

某些特定腫瘤的基因分型，對(duì)之后的治療方案、靶向藥物的選擇和治療結(jié)局等都有一定的指示作用，故利用適當(dāng)?shù)幕驕y(cè)序技術(shù)，對(duì)其進(jìn)行個(gè)體化分型，成為未來(lái)腫瘤治療的一大趨勢(shì)。Timmermann等[17]發(fā)現(xiàn)，由于全外顯子組測(cè)序可以平行探測(cè)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability,MSI) 結(jié)直腸癌的頻發(fā)突變，潛在錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair, MMR)機(jī)制的缺失甚至對(duì)結(jié)直腸癌亞型的高頻突變?nèi)鏐RAF、KRAS和TP53進(jìn)行測(cè)定，使其可能成為未來(lái)結(jié)直腸癌基因分型的工具。

2.3　腫瘤轉(zhuǎn)移遺傳學(xué)

轉(zhuǎn)移作為惡性腫瘤的一大特征，是腫瘤患者死亡的最常見(jiàn)原因，但目前對(duì)于腫瘤轉(zhuǎn)移遺傳學(xué)的所知甚少。Harbour等[18]經(jīng)過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)移性的葡萄膜黑素瘤進(jìn)行外顯子組捕獲及高通量平行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)BAP1(BRCA1-關(guān)聯(lián)蛋白1)的缺失與該病高轉(zhuǎn)移性相關(guān)。另外，胰腺癌預(yù)后不佳常常與其不能早期診斷及早期遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。Yachida等[19]報(bào)道，對(duì)7例轉(zhuǎn)移胰腺癌患者進(jìn)行基因測(cè)序，除評(píng)估原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶之間同源細(xì)胞關(guān)系之外，亦對(duì)胰腺癌的遺傳學(xué)演變進(jìn)行 了研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞原始突變的發(fā)生至原位腫瘤親代細(xì)胞的產(chǎn)生至少需要10年時(shí)間，之后獲得轉(zhuǎn)移能力至少經(jīng)歷5年，轉(zhuǎn)移后患者平均在2年內(nèi)死亡。其結(jié)論提示，可以通過(guò)研究腫瘤進(jìn)展的遺傳學(xué)特征，明確腫瘤轉(zhuǎn)移前的時(shí)間窗，以期早期發(fā)現(xiàn)，預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的死亡結(jié)局[20]。

2.4　選擇腫瘤治療的相關(guān)靶點(diǎn)

Pasqualucci等[21]關(guān)于B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤中最常見(jiàn)類型——彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤以及濾泡性淋巴瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，基因組結(jié)構(gòu)的改變使得與組蛋白及非組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶高度相關(guān)的基因CREBBP和EP300鈍化，其表達(dá)不足造成BCL6和p53的乙?；蛔?，最終導(dǎo)致相關(guān)腫瘤蛋白的激活以及p53腫瘤抑制基因活性的下調(diào)，提示可利用藥物針對(duì)乙酰化/去乙?；M(jìn)行靶向治療。Timmermann等[17]研究顯示，結(jié)直腸癌中BRAF、KRAS、FGFR2、MTOR等腫瘤藥物靶區(qū)的基因突變，直接影響腫瘤藥物的治療效果。Parsons等[14]在兒童髓母細(xì)胞瘤的研究中，發(fā)現(xiàn)一種特別類型的組蛋白甲基化在該腫瘤形成中的作用，提供靶向抑瘤的研究方向。Jiao等[22]在胰腺內(nèi)分泌腫瘤的研究中，除了發(fā)現(xiàn)關(guān)于DAXX、ATRX、MEN1等突變導(dǎo)致的染色體重組，亦顯示14%的該腫瘤患者存在鈉巴霉素的靶向通路(mammalian target of rapamycin, mTOR)相關(guān)基因的突變，從而使得篩選該類患者進(jìn)行mTOR抑制治療存在可能。

因此，通過(guò)全外顯子組測(cè)序技術(shù)獲得腫瘤基因突變相關(guān)的最佳藥物靶點(diǎn)，改變相應(yīng)代謝途徑，或可能成為未來(lái)腫瘤個(gè)體化治療的金標(biāo)準(zhǔn)。

2.5　提示腫瘤預(yù)后

Yan等[23]研究顯示, 在急性單核細(xì)胞性白血病(AML-M5)患者中，DNMT3A 基因突變導(dǎo)致了DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性降低，并表現(xiàn)出對(duì)組蛋白H3的異常親和力。DNA甲基化作為重要的基因組修飾，調(diào)控著許多重要細(xì)胞過(guò)程，其與腫瘤發(fā)生的相關(guān)性也已被證實(shí)。研究者經(jīng)分析后發(fā)現(xiàn)DNMT3A作為與總生存率相關(guān)的獨(dú)立預(yù)后變量，攜帶該基因常顯示預(yù)后不佳。而Jiao等[22]關(guān)于胰腺內(nèi)分泌腫瘤臨床研究中顯示，DAXX、ATRX、MEN1基因突變則提示較好預(yù)后。

2.6　應(yīng)用于干細(xì)胞研究

腫瘤干細(xì)胞(Cancer Sterm Cells, CSCs)學(xué)說(shuō)認(rèn)為腫瘤中存在著一類細(xì)胞，其抗調(diào)亡能力、成瘤能力、遷徙和侵襲能力等與占大多數(shù)分化程度較高的腫瘤細(xì)胞存在差異[24]，是腫瘤無(wú)限增殖、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源[25]。該理論為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等機(jī)制的研究提供了全新的視角。目前，全外顯子組測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于干細(xì)胞，甚至是腫瘤干細(xì)胞的研究尚處于初步階段。Howden等[26]在對(duì)于1例視網(wǎng)膜環(huán)狀萎縮患者誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(IPS cell)的遺傳校正及分析研究中，對(duì)IPS細(xì)胞株進(jìn)行最初的重編程、基因靶向、選擇性片段移除后，聯(lián)合應(yīng)用全外顯子組測(cè)序技術(shù)與aCGH方法，評(píng)估其基因組完整性。找到該患者原始IPS細(xì)胞的蛋白質(zhì)編碼區(qū)域中共有1個(gè)基因缺失、2個(gè)基因擴(kuò)增以及9個(gè)基因突變。為研究該疾病IPS細(xì)胞分化潛能的機(jī)制提供了新思路。Totoki等[27]在關(guān)于肝細(xì)胞癌的基因組研究顯示，發(fā)現(xiàn)的47個(gè)非同義突變中的TSC1復(fù)合體的無(wú)義突變僅在小部分的腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)，并與負(fù)性調(diào)節(jié)鈉巴霉素的哺乳動(dòng)物靶向通路有關(guān)，成為與該腫瘤細(xì)胞的“干性”表達(dá)、生長(zhǎng)、代謝相關(guān)的重要致癌途徑。

綜上所述，目前全外顯子組測(cè)序技術(shù)在腫瘤學(xué)的應(yīng)用仍處于較早期的階段。相比于傳統(tǒng)全基因組測(cè)序技術(shù)，其低花費(fèi)、高產(chǎn)量已成為明顯的優(yōu)勢(shì)，在腫瘤分子生物學(xué)的研究和臨床應(yīng)用方面顯示了多方面的影響。相信隨著測(cè)序成本的進(jìn)一步降低，通過(guò)該技術(shù)對(duì)腫瘤進(jìn)行基因水平的診斷、分型，治療靶點(diǎn)的確立以及預(yù)后的分析等，將成為未來(lái)腫瘤分子生物學(xué)及個(gè)體化治療的有效手段。

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