郭世奎，　王昆華，　龔昆梅，　肖　樂，　包維民，　雷　毅，　師　義

結(jié)腸癌手術(shù)是腹部外科最常施行的術(shù)式之一，了解結(jié)腸癌患者術(shù)前腸道菌群狀況和腸道準(zhǔn)備及手術(shù)創(chuàng)傷對腸道菌群的影響，對指導(dǎo)臨床治療具有重要意義。本研究應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)對結(jié)腸癌患者手術(shù)前后糞便菌群中的擬桿菌屬、梭桿菌屬、梭菌屬、脆弱擬桿菌、壞死梭桿菌、肉毒梭菌和艱難梭菌進(jìn)行定量分析，比較結(jié)腸癌患者手術(shù)前后腸道菌群的差異，揭示結(jié)腸癌手術(shù)處理對腸道相關(guān)菌群微生態(tài)的影響，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1　資料與方法

1.1　臨床資料

2008年10月至2010年10月我科共收治結(jié)腸癌患者60例，男38例，女22例；年齡(65.0±16.4)歲，所有患者均于結(jié)腸鏡下取材行病理檢查證實為結(jié)腸癌，其中右半結(jié)腸癌21例，左半結(jié)腸癌39例，術(shù)前均無腸梗阻、腸穿孔及腸炎，無嚴(yán)重全身性疾病等并發(fā)癥或伴發(fā)病，均未行放化療。所有患者術(shù)前1周停用抗生素，術(shù)前1天口服復(fù)方聚乙二醇電解質(zhì)散進(jìn)行腸道準(zhǔn)備。手術(shù)方式為結(jié)腸癌根治術(shù)。分別于術(shù)前3天和術(shù)后停用抗生素7日并恢復(fù)飲食后留取標(biāo)本。

1.2　引物的設(shè)計與合成

梭菌屬參照Skanseng等的報道[1]，梭桿菌屬參照Kato等的報道[2]，肉毒梭菌參照Fach等的報道[3]，壞死梭桿菌參照J(rèn)ensen等的報道[4]，艱難梭菌參照Denève等的報道[5]。擬桿菌屬根據(jù)其cfxA基因，脆弱擬桿菌根據(jù)其cfiA基因系列設(shè)計引物。這7對引物用BLAST進(jìn)行在線核實其特異性后，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物系列見表1。

表1　細(xì)菌的PCR擴增引物系列

1.3　試劑與儀器

試劑為細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒(離心柱型)，Real Master Mix(SYBR Green I)，瓊脂糖，DNA提取液，DNA分子標(biāo)準(zhǔn)Marker，TaqDNA多聚酶。儀器為Hfsafe-1200TE全排型生物安全柜，超凈工作臺，低溫高速離心機，純水器，移液器，核酸蛋白檢測儀Biophotmeter，溫度梯度PCR擴增儀，定量Light Cycler PCR儀。

1.4　糞便細(xì)菌DNA的提取

分別于術(shù)前3天和術(shù)后停用抗生素7日并恢復(fù)飲食后取新鮮糞便，用天平稱取中段，每份500 mg，收集在標(biāo)本袋中，置于冰上，取回實驗室后-4℃冰箱保存，時間不超過1 h。預(yù)處理后，按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明，提取糞便細(xì)菌DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5　常規(guī)PCR反應(yīng)

反應(yīng)體系25 μL：10×Buffer 2.5 μL，MgCl22.5 μL，dNTP 1 μL，上、下游引物各1 μL，Taq酶(2.5U/μL) 0.4 μL，模板DNA 2.0 μL，ddH2O 15 μL。95 ℃，預(yù)變性5 min，95 ℃變性20 s，擬桿菌屬57 ℃、梭桿菌屬58 ℃、梭菌屬59 ℃、脆弱類桿菌60 ℃、壞死梭桿菌60 ℃、肉毒梭菌61 ℃、艱難梭菌61 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)40次，72 ℃后延伸5 min，-4 ℃保存。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物6 μL與溴酚藍(lán)2.5 μL混勻上樣，將2.0% 瓊脂糖凝膠放入1×TAE緩沖液中進(jìn)行電泳，電壓60 V，時間90 min，電泳結(jié)束后用凝膠成像分析系統(tǒng)攝像。

1.6　實時熒光定量PCR反應(yīng)

將待測糞便樣品中提取的DNA分別進(jìn)行7種細(xì)菌的SYBR Green I 實時熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：Real Master Mix：9 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 2.0 μL，ddH2O 7 μL，反應(yīng)體積為20 μL，最后加石蠟油 8 μL封帽。反應(yīng)條件：95 ℃，預(yù)變性2 min，循環(huán)1次；定量程序：95 ℃變性20 s，擬桿菌屬57 ℃、梭桿菌屬58 ℃、梭菌屬59 ℃、脆弱類桿菌60 ℃、壞死梭桿菌60 ℃、肉毒梭菌61 ℃、艱難梭菌61 ℃退火10 s，68 ℃ 延伸30 s，循環(huán)40次；74 ℃，30 s，循環(huán)1次，每次實驗同時設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品校正和ddH2O代替DNA模板作為陰性對照，反應(yīng)完畢后根據(jù)溶解曲線分析PCR產(chǎn)物的特異性，并由Light Cycler PCR儀分析定量結(jié)果。

1.7　標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取糞便基因組DNA用擬桿菌屬，梭桿菌屬，梭菌屬，脆弱擬桿菌，壞死梭桿菌，肉毒梭菌，艱難梭菌引物進(jìn)行特異性擴增，將出現(xiàn)目的條帶的擴增產(chǎn)物按普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒說明進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物用核酸蛋白檢測儀Biophotmeter測定濃度，并將其換算為各標(biāo)準(zhǔn)品1 μL的拷貝數(shù)，即等于6.02×1023×濃度(g/mL)/分子量(g/mol)，其中分子量(g/mol)=擴增片段長度×660，(擬桿菌屬3.95×1014，梭桿菌屬5.16×1014，梭菌屬2.02×1014，脆弱擬桿菌3.76×1014，壞死梭桿菌1.9×1014，肉毒梭菌3.77×1014，艱難梭菌3.62×1014)用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將各純化產(chǎn)物做10倍系列稀釋，使之成為(1×108～1×104)copies/mL，作為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行SYBR Green I 實時熒光定量PCR反應(yīng)。根據(jù)讀取的熒光數(shù)據(jù)，由系統(tǒng)軟件自動分析循環(huán)閾值(Cycle threshold, Ct)，并生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8　統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1　引物特異性檢測

用2%瓊脂糖凝膠電泳分析常規(guī)PCR產(chǎn)物，以Marker為標(biāo)準(zhǔn)。可見常規(guī)PCR產(chǎn)物均顯示特異性條帶，與預(yù)期的DNA片段長度相吻合(見圖1)。

圖1　PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

2.2　擴增曲線

不同拷貝數(shù)的模板循環(huán)數(shù)與熒光強度的關(guān)系圖見圖2(以梭菌屬為例)，從圖中可以看出梭菌屬不同拷貝數(shù)的模板隨循環(huán)數(shù)的增加，熒光強度逐漸增強，在經(jīng)過一段指數(shù)擴增期后曲線趨于平行，即出現(xiàn)“平臺效應(yīng)”，其定量分析在指數(shù)擴增期進(jìn)行。其他幾種細(xì)菌也同上。

圖2　7份術(shù)前標(biāo)本梭菌屬PCR擴增曲線圖(顯示熒光強度與循環(huán)數(shù)的關(guān)系)

2.3　標(biāo)準(zhǔn)曲線

以對數(shù)轉(zhuǎn)換后的拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，以定量PCR反應(yīng)過程中達(dá)到熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)為縱坐標(biāo)得到各細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖3)，為待測樣品的定量提供了參照標(biāo)準(zhǔn)。

2.4　溶解曲線

通過對溶解曲線的分析，進(jìn)一步驗證引物的特異性。7種細(xì)菌的溶解曲線均為單峰，說明擴增產(chǎn)物單一，以梭菌屬為例，與SYBR Green Ⅰ熒光染料結(jié)合的為目的DNA片段，見圖4。

2.5　PCR擴增產(chǎn)物純化獲得DNA測序結(jié)果

測序所得系列與梭菌屬基因系列完全一致。說明擴增產(chǎn)物是梭菌屬，引物特異性高(見圖5)。

圖3　術(shù)前標(biāo)本梭菌屬的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(取104、105、106、107、108制做標(biāo)準(zhǔn)曲線)

圖4　7份術(shù)前標(biāo)本梭菌屬的溶解曲線，顯示產(chǎn)物TM值為88.01℃～89.05℃時引物的特異性好

圖5　梭菌屬擴增產(chǎn)物純化獲得DNA測序結(jié)果

2.6　糞便的細(xì)菌定量結(jié)果

每份糞便標(biāo)本所含的7種細(xì)菌的拷貝數(shù)可通過Ct值與標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得到。結(jié)腸癌患者術(shù)后糞便中的擬桿菌屬、梭桿菌屬及梭菌屬及脆弱擬桿菌、壞死梭桿菌、肉毒梭菌及艱難梭菌數(shù)量均較術(shù)前明顯減少，見表2。

表2　糞便標(biāo)本細(xì)菌定量的結(jié)果

注：結(jié)腸癌(n=60)手術(shù)前、后的比較，用配對t檢驗，檢測7種細(xì)菌差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

3　討論

結(jié)腸癌是人類常見的惡性腫瘤，人類消化道內(nèi)約有1014個活細(xì)菌，占正常成人糞便重量的60%[6]，由30個屬400～500種細(xì)菌組成[7]。腸道中細(xì)菌的組成、數(shù)量及活性，在維持人體健康中起重要作用[8]。本研究通過對結(jié)腸癌患者手術(shù)前后腸道中的擬桿菌屬、梭桿菌屬、梭菌屬、脆弱擬桿菌、壞死梭桿菌、肉毒梭菌及艱難梭菌進(jìn)行定量分析，以了解手術(shù)前后結(jié)腸癌患者糞便菌群的主要變化。結(jié)果顯示，結(jié)腸癌患者糞便中擬桿菌屬、梭桿菌屬、梭菌屬、脆弱擬桿菌、壞死梭桿菌、肉毒梭菌及艱難梭菌的數(shù)量在手術(shù)后均有明顯減少，與手術(shù)前比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。有研究顯示結(jié)腸癌患者腸道菌群出現(xiàn)微生態(tài)量的變化可能與結(jié)腸癌的復(fù)發(fā)、發(fā)展有關(guān)，但機制不明[9]，并且腸道菌群改變時，腸道細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物作用于基因易感性宿主，使之產(chǎn)生免疫應(yīng)答，三者在腸癌的開始和持續(xù)發(fā)展中起到了重要的協(xié)同作用[10]。本研究與Tannock[11]的研究一致，與我們前期研究[12]亦一致。因此，根據(jù)所確立的患者具體的腸道菌群量的變化，為結(jié)腸癌的預(yù)防及診治提供了新視角，并通過檢測腸道菌群改變，進(jìn)行篩查，確定結(jié)腸癌高危人群，行飲食干預(yù)及相關(guān)檢查，達(dá)到早期診斷，早期治療的目的。

本研究對于揭示手術(shù)處理對腸道菌群的影響，為結(jié)腸癌患者術(shù)后臨床營養(yǎng)支持和相關(guān)處理的選擇，尋找結(jié)腸癌術(shù)后最佳治療方案，以及個體化治療提供了理論依據(jù)和指導(dǎo)意義。

總之，本研究應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)，實現(xiàn)了對擬桿菌屬、梭桿菌屬、梭菌屬、脆弱擬桿菌、壞死梭桿菌、肉毒梭菌及艱難梭菌等難培養(yǎng)的腸道細(xì)菌進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌患者術(shù)后上述細(xì)菌明顯減少，提示結(jié)腸癌手術(shù)處理對腸道菌群有一定的影響，為圍手術(shù)期的腸道菌群調(diào)理及術(shù)后營養(yǎng)支持提供了理論依據(jù)[13]。同時，應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)為結(jié)腸癌患者腸道菌群組成，動態(tài)變化及相關(guān)的研究提供了一種有效檢測手段，為臨床診治結(jié)腸癌患者術(shù)后腸道菌群失調(diào)提供新的視角。

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