孫安科 胡平 李萬同 孟慶延 陳偉 唐維維

目前以種子細(xì)胞和生物材料為基本要素、以再生和應(yīng)用預(yù)定形態(tài)軟骨組織為基本目標(biāo)的軟骨組織工程研究正深入展開。喉是全身軟骨組織相對集中的部位，生理功能與美學(xué)意義依賴支架軟骨的完整性，喉軟骨腔狀支架的特性決定了應(yīng)用組織工程技術(shù)構(gòu)建過程中繼續(xù)探索合適生物材料及其塑形技術(shù)的重要性。與簡單的再生片狀軟骨不同，作為喉支架形態(tài)軟骨組織工程生物材料，除了應(yīng)具有良好的生物相容性、適宜的降解性和合理的孔隙結(jié)構(gòu)外，還應(yīng)具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度和靈活的塑性要求。本研究在軟骨組織工程研究的基礎(chǔ)上[1，2]，嘗試應(yīng)用新型生物材料聚羥基丁酸酯與聚羥基己酸酯共聚物[poly(3-hydroxybutyrate-co -3-hydroxyhexanoate，PHBHH)]來探索組織工程生物材料喉支架形態(tài)塑形物的制備及其與軟骨細(xì)胞的相容性，為組織工程喉軟骨的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1主要儀器、試劑和材料 聚羥基丁酸酯與聚羥基己酸酯共聚物(PHBHH，分子量為60萬，清華大學(xué)化學(xué)工程系提供)。DMEM/Ham-F12培養(yǎng)基(Gibco,美國)，Ⅱ型膠原酶(Sigma,美國)，多聚賴氨酸(Mr:18.9萬；Sigma,美國)，胎牛血清(Fatal bovine serum,FBS,浙江四季青生物制品公司)，胰蛋白酶(Sigma,美國)，氯仿(上?；瘜W(xué)試劑有限公司)，乙醇(上?；瘜W(xué)試劑有限公司)，倒置相差顯微鏡(Olympus,日本)，掃描電鏡(日本日立S550)，CO2培養(yǎng)箱(Queue,美國)。新西蘭白兔乳兔和成兔(沈陽軍區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。

1.2多孔PHBHH制備及其喉支架形態(tài)塑形

1.2.1塑形模具制備 以成年人全喉軟骨形態(tài)為塑形參照，按3：1縮小制備出塑鋼模型。以聚四氟乙烯為模具材料，雕刻出相應(yīng)形態(tài)的陰模，模具由一個(gè)內(nèi)芯和兩塊外板組成(圖1)。

1.2.2多孔PHBHH制備與塑形 采用溶劑澆鑄、模壓成形和顆粒濾瀝方法[3]制備具有喉支架形態(tài)生物材料塑形物。方法：定量PHBHH絮狀材料置入球形耐熱玻璃容器內(nèi)，加入一定比例的氯仿溶劑，密封條件下加熱回流，磁性攪拌器充分?jǐn)嚢瑁芤撼删鶆虻南『隣詈?，迅速倒入盛有氯化鈉鹽粒(篩分為150～200 μm)的廣口瓶內(nèi)，密封瓶口，室溫下過夜(使材料自然滲入鹽層內(nèi))。取材料與鹽的混合物先制備成片狀，然后包裹模具芯部，再左右合攏外模，金屬夾具固定，液體壓縮成形。脫模樣品置通風(fēng)櫥中至少48小時(shí)，使氯仿充分蒸發(fā)。然后放入真空抽濾器中抽濾12小時(shí)以除去可能殘留的氯仿。將所得樣品置一金屬網(wǎng)內(nèi)，懸于盛三蒸水的玻璃容器內(nèi)，磁力攪拌，濾瀝除鹽，三蒸水至少更換三次。除去鹽粒的樣品自然干燥后做孔隙率測定。

1.2.3多孔PHBHH孔隙率測定 采用液體置換法[4]，因?yàn)镻HBHH類生物材料具有親油性，故以乙醇替代水，使得液體更易滲入材料的內(nèi)部。測定方法：在一支可封閉的帶刻度的試管中加入一定體積(V1)的乙醇，稱取質(zhì)量為M的待測試樣加入試管內(nèi)，密封，8小時(shí)后開蓋一次(以釋放氣體)，再次封閉，24小時(shí)后乙醇足夠滲入試樣內(nèi)的所有孔隙，記下此時(shí)的體積V2。飽和了乙醇的試樣取出后，此時(shí)試管內(nèi)乙醇的體積記為V3。則材料的密度ρ=M/(V2-V3)，孔隙率e =(V1-V3)/(V2-V3)×100%。

1.2.4材料消毒與表面助粘 喉支架形態(tài)材料塑形物應(yīng)用前以75%酒精浸泡2小時(shí)，取出后無菌環(huán)境下晾半干，大量PBS漂洗至少3遍，干燥，無菌多聚賴氨酸溶液浸1小時(shí)，干燥后備用。

1.3PHBHH材料喉支架與軟骨細(xì)胞復(fù)合

1.3.1軟骨細(xì)胞獲取 每批10只1周齡新西蘭白兔乳兔，雌雄不限，無菌條件下取其肋軟骨和關(guān)節(jié)軟骨，去凈軟骨膜，0.1 mol/L滅菌磷酸緩沖液(0.1 mol/L PBS，含青、鏈霉素各200 U/ml)沖洗2遍，0.25%胰蛋白酶先消化2 min，PBS沖洗3遍；然后剪切成1～2 mm3左右碎塊，PBS再浸洗一遍；置50 ml小燒杯中，加0.3%Ⅱ型膠原酶，37 ℃攪拌消化，自1小時(shí)起，每半小時(shí)收集細(xì)胞1次，直到全部固體物消失。所獲細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀用PBS洗2遍；DMEM/Ham-F12(1:1)混合培養(yǎng)液(含20% FBS)重懸細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色，細(xì)胞計(jì)數(shù)板(細(xì)胞計(jì)數(shù)板)法計(jì)數(shù)(染色細(xì)胞判為失活力細(xì)胞，拒染細(xì)胞為活力細(xì)胞)。以2×105/ml濃度接種于100 ml培養(yǎng)瓶內(nèi)，48小時(shí)換液1次，細(xì)胞貼滿壁后傳代。收集第3代培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，離心后制成細(xì)胞懸液備用。

1.3.2細(xì)胞與PHBHH材料喉支架復(fù)合 調(diào)整細(xì)胞懸液為5×107個(gè)/ml，采用多點(diǎn)播散方法將細(xì)胞懸液接種于經(jīng)培養(yǎng)液預(yù)濕后約七成干燥的塑形材料上，12個(gè)PHBHH材料喉支架分3批接種，每批4個(gè)，接種時(shí)每次少量吸取細(xì)胞懸液，均勻點(diǎn)播，盡可能使細(xì)胞分布密度一致，塑形材料中空的內(nèi)面以彎頭吸管接種細(xì)胞。細(xì)胞與材料復(fù)合后置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)孵育半小時(shí)取出，調(diào)整塑形材料的上下放置狀態(tài)，將圍繞材料底部的細(xì)胞懸液吸出再次自上而下接種，反復(fù)2次后，靜止孵育1小時(shí)，再加入新鮮培養(yǎng)液，加入量以浸潤復(fù)合物2 cm以上為宜。以后每48小時(shí)換液1次，倒置顯微鏡下觀察復(fù)合物邊緣細(xì)胞生長及附著情況。細(xì)胞與材料復(fù)合物體外共同培養(yǎng)1周，每批取1個(gè)用于本研究。

1.4PHBHH材料喉支架與軟骨細(xì)胞復(fù)合物掃描電鏡觀察 PHBHH材料喉支架-細(xì)胞復(fù)合物在無菌蒸餾水中刷洗1次后迅速置2.5%戊二醛中固定，然后梯度酒精脫水、真空抽干，鋒利刀片切開支架形態(tài)培養(yǎng)物，上、中、下部位取材，粘托，離子淺射噴金鍍膜后掃描電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1多孔PHBHH喉支架形態(tài)塑形物外觀 經(jīng)模壓成形的PHBHH材料喉支架軟骨形態(tài)外觀呈中空半面喇叭狀，棱角分明，形態(tài)逼真，濾瀝除鹽后整體結(jié)構(gòu)呈多孔海綿狀(圖2)。

2.2多孔PHBHH孔隙率 經(jīng)溶劑澆鑄、模壓成形和顆粒濾瀝處理獲取的喉支架形態(tài)多孔PHBHH材料，飽和乙醇液體置換法測定其孔隙率為92%±2%，孔徑100～150 μm，厚度1.5 mm左右。

2.3負(fù)載軟骨細(xì)胞的PHBHH材料喉支架體外培養(yǎng)觀察 接種細(xì)胞后24小時(shí)，倒置顯微鏡下邊緣觀察見細(xì)胞附于材料表面，第二次換液時(shí)肉眼下即可見材料表面有薄層透明膠凍狀物均勻分布，培養(yǎng)1周膠凍樣物質(zhì)明顯增多 (圖3) 。

2.4掃描電鏡觀察

2.4.1單純多孔PHBHH材料 呈多孔海綿狀，彼此之間連性好，孔徑約100～150 μm(圖4)。

2.4.2PHBHH材料與細(xì)胞復(fù)合物 細(xì)胞密布材料表面及其海綿狀空隙中，呈單個(gè)、串狀或簇狀分布，細(xì)胞周圍黏液狀的基質(zhì)物質(zhì)相互間有粘連，高倍鏡下可見軟骨細(xì)胞表面呈現(xiàn)多個(gè)類圓形小突起，可能為軟骨細(xì)胞分泌的尚未融合的基質(zhì)成分(圖5)。

圖1 以聚四氟乙烯為模具材料，雕刻的制備喉形態(tài)模具，由一個(gè)內(nèi)芯和兩塊外板組成圖2 制備出的喉支架形態(tài)PHBHH生物材料塑形物圖3 負(fù)載軟骨細(xì)胞的PHHHB材料喉支架體外共同培養(yǎng)一周倒置顯微鏡下觀察(×100)圖4 制備的多孔PHBHH泡沫材料掃描電鏡觀察(×500)圖5 負(fù)載軟骨細(xì)胞的PHHHB材料掃描電鏡觀察(×1 000)

3 討論

組織工程技術(shù)為喉支架形態(tài)軟骨修復(fù)重建提供了新思路和新方法，但在耳鼻咽喉科領(lǐng)域，軟骨組織工程研究并未呈現(xiàn)出其應(yīng)有的優(yōu)勢，究其原因可能在于喉軟骨屬中空不規(guī)則結(jié)構(gòu)軟骨框架，框架形態(tài)組織工程化軟骨的構(gòu)建與應(yīng)用除了對種子細(xì)胞質(zhì)量與數(shù)量有較高要求外，對其細(xì)胞外基質(zhì)材料的生物相容性、降解性、孔隙結(jié)構(gòu)、機(jī)械強(qiáng)度和塑形條件也有較高要求。 目前可作為軟骨組織工程細(xì)胞外基質(zhì)材料的生物材料主要包括以下四大類：天然生物材料(膠原、纖維蛋白和殼聚糖等)、人工合成生物材料[聚羥基乙酸(polyglycolic acid ，PGA)等]、由微生物合成的新型生物材料[聚羥基烷酸酯類生物材料及其共聚物(polyhydroxy alkanotes,PHAs)和復(fù)合材料(聚乳酸-膠原和纖維蛋白-聚氨酯)等][5]。這些生物材料在生物相容性、降解速率控制、內(nèi)部結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、細(xì)胞黏附性、代謝微環(huán)境、機(jī)械強(qiáng)度及塑形靈活性等方面各有其優(yōu)缺點(diǎn)，天然生物材料缺乏足夠的機(jī)械強(qiáng)度，人工合成與復(fù)合生物材料普遍存在價(jià)格昂貴、加工工藝復(fù)雜、不易塑形等問題。雖然目前針對眾多應(yīng)用于軟骨組織工程的生物材料尚缺乏系統(tǒng)的對照研究與統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，也還沒有一種生物材料能完全符合軟骨構(gòu)建與應(yīng)用的要求，但對于塑形要求較高的中空框架狀軟骨組織工程研究，新型生物材料PHAs顯示出較好的性能[6]。

PHAs類材料是微生物在碳源過量，而氮源、磷源缺乏時(shí)，積累在體內(nèi)作為營養(yǎng)和能量儲(chǔ)存物質(zhì)參與細(xì)胞代謝的天然物質(zhì)，由微生物制造獲取的PHAs，不含人工合成生物材料可能殘留的有害物質(zhì)，是極潔凈的生物材料之一。PHAs具有高熔點(diǎn)、高結(jié)晶度、高分子量、耐拉伸和生物相容性良好、無致炎性、無排斥性和易降解等特點(diǎn),而且與聚羥基乙酸(PGA)和聚羥基丙酸(PLA)相比，PHAs類材料酸性較弱，因此降解產(chǎn)物的酸性反應(yīng)明顯低于PGA和PLA[6，7]。研究表明，PHAs系列聚合物中，隨著單體碳數(shù)的增加，力學(xué)性能存在著從脆性到粘性的轉(zhuǎn)變。由于該系列聚合物種類較多，且聚合物之間有較好的相容性，通過對不同聚合物的優(yōu)勢組合，可以得到具有更佳強(qiáng)度、韌性、生物相容性和可控降解性的組織工程支架材料。由聚羥基丁酸酯[poly(3-hydroxybutyrate) ，PHB]與聚羥基已酸酯[poly(3-hydroxyhexanoate)，PHH]共聚而成的優(yōu)化PHAs材料聚羥基丁酸已酸酯[poly(3-hydroxybutyrate-co -3-hydroxyhexanoate)，PHBHH]，不但具有PHAs類材料的優(yōu)點(diǎn)，而且價(jià)格低廉、來源充裕、體內(nèi)代謝及其生物反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)較充分，是值得關(guān)注與進(jìn)一步研究的軟骨組織工程生物材料之一[8]。

本研究以PHBHH絮狀物為原料，采用溶劑澆鑄、模壓成形方法制備喇叭狀喉支架形態(tài)PHBHH材料塑形物，濾瀝除鹽后支架塑形物形態(tài)保持良好，具有相當(dāng)?shù)臋C(jī)械強(qiáng)度。掃描電鏡顯示制備的塑形物材料呈多孔海綿狀，孔徑與篩分氯化鈉鹽粒大小基本相符。經(jīng)乙醇體積浸潤法測定海綿狀材料孔隙率大于90%，符合組織工程生物材料多孔狀、高孔隙率和具有一定機(jī)械強(qiáng)度的基本要求，為組織工程技術(shù)構(gòu)建和應(yīng)用像喉、氣管這樣中空狀支架組織與器官提供了又一種選擇材料。

為探討多孔海綿狀PHBHH材料能否作為理想的軟骨組織工程種子細(xì)胞載體，本實(shí)驗(yàn)通過掃描電鏡觀察了體外培養(yǎng)的細(xì)胞-材料復(fù)合物中細(xì)胞與材料粘附、細(xì)胞分布、細(xì)胞生長及分泌基質(zhì)狀況等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)多聚賴氨酸表面助粘的海綿狀多孔PHBHH材料接種軟骨細(xì)胞后細(xì)胞黏附率高、分布均勻，細(xì)胞-材料復(fù)合培養(yǎng)一定時(shí)間細(xì)胞周圍及細(xì)胞與細(xì)胞間可見豐富的膠凍狀物質(zhì)，基質(zhì)分泌旺盛，高倍鏡下細(xì)胞表面呈現(xiàn)的多個(gè)顆粒狀小體可能為細(xì)胞分泌的基質(zhì)成分，說明細(xì)胞在材料表面生長狀況良好。隨著研究的深入，今后以人離體軟骨作為種子細(xì)胞來源觀察與PHBHH的相容性將更宜于臨床應(yīng)用。

本研究表明以溶劑澆鑄、模壓成形和濾瀝除鹽技術(shù)制備的喉支架形態(tài)組織工程PHBHH泡沫多孔生物材料具有良好的機(jī)械強(qiáng)度、孔隙率和細(xì)胞相容性，是中空支架形態(tài)組織工程化軟骨組織構(gòu)建與應(yīng)用可選擇的制備技術(shù)與生物材料之一。但其作為一種代替軟骨的中空支架形材料，在受到內(nèi)、外壓力時(shí)，承受多大的壓力而能保持其形態(tài)和內(nèi)腔大小不變需要進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

迄今軟骨組織工程研究已取得相當(dāng)大進(jìn)展[9,10]，但在喉支架形態(tài)軟骨構(gòu)建與應(yīng)用方面尚未呈現(xiàn)出作為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)新技術(shù)的優(yōu)勢，面臨著諸如血管化、黏膜化、柔韌化、復(fù)合化和支撐化腔狀軟骨及其附屬組織共同構(gòu)建與移植技術(shù)方法創(chuàng)立與完善的難題。以組織工程喉支架形態(tài)軟骨研究為出發(fā)點(diǎn)，首先設(shè)想將組織工程軟骨與組織瓣移植技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用于喉支架軟骨病損的修復(fù)重建，有望使組織工程化喉支架形態(tài)軟骨早日實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用。在此基礎(chǔ)上，繼續(xù)不懈的探索支架形態(tài)組織工程軟骨與黏膜、肌肉、韌帶等復(fù)合化組織構(gòu)建與應(yīng)用的技術(shù)方法將是今后努力的目標(biāo)。

4 參考文獻(xiàn)

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