AN221 HPLC-UV、Acclaim混合基質(zhì)柱WCX-1快速檢測液體奶和奶粉中的三聚氰胺

戴安(DIONEX)儀器分析園地

三聚氰胺是一種用于塑料和化學肥料生產(chǎn)的化學原料.最近出現(xiàn)了一些嬰兒食品(奶粉)被三聚氰胺污染的現(xiàn)象.不法分子通過摻加三聚氰胺來提高奶粉中蛋白質(zhì)測定量，三聚氰胺也被摻到動物飼料中以提高蛋白質(zhì)測定量.

三聚氰胺的定量檢測方法有酶免疫測定法(EIA)、GC-MS、LC-MS、HPLC-UV等.中國政府頒布的檢測原奶和奶制品中三聚氰胺檢測方法包括了HPLC-UV、LC-MS和GC-MS，但是GC/LC-MS的正常運行需要很高的成本，并且GC-MS樣品衍生化需要較高的勞動強度，這樣就限制了該標準在奶制品企業(yè)中的推廣應用，因此HPLC-UV方法仍是目前在奶制品企業(yè)中普及的檢測方法.針對大批量需要檢測的原奶，推薦另一種HPLC-UV方法快速檢測原奶，但是該方法在奶制品的檢測中具有局限性.

本文介紹一種簡單的HPLC方法，同時快速檢測液體奶和奶粉中三聚氰胺.該方法使用Acclaim混合基質(zhì)WCX-1色譜柱、UltiMate? 3000 HPLC-UV高效液相色譜、醋酸鹽緩沖液和乙腈為流動相進行檢測.單個樣品10 min內(nèi)完成分析.Acclaim混合基質(zhì)WCX-1色譜柱使用硅膠基質(zhì)，其分離原理含有疏水和弱離子交換特點，對離子化和中性的化合物表現(xiàn)出了很好的分離特性.使用UltiMate? 3000 HPLC-UV高效液相色譜和Acclaim混合基質(zhì)WCX-1色譜柱能同時快速分析液體奶和奶粉中的三聚氰胺.

1 實驗方法

1.1 儀器與試劑

儀器:Dionex UltiMate 3000 HPLC系統(tǒng)包括有HPG 3400A泵，WPS 3000TSL自動進樣器，TCC-3000柱溫箱，VWD-3400RSUV-Vis檢測器.Dionex SummitUVD-340U PDA，Chromeleon? 6.80 SP5工作站.Kudos? SK3200LH 超聲波發(fā)生器(KudosUltrasonic Instrumental Co.，Shanghai，China)，梅特勒 Toledo AL-204 電子天平(梅特勒(上海)公司，上海)，Anke?TGL-16B離心機(Anting科學儀器公司，上海)，IKA? MS1微型振蕩器(廣州)

試劑與標準品:水，Milli-Q? Gradient A 10;甲醇(CH3OH)，HPLC級，F(xiàn)isher;乙腈(CH3CN)，HPLC級，F(xiàn)isher;醋酸銨(NH4Ac)，分析純，SCRC，China;醋酸(HAc)，分析純，SCRC，China;辛烷磺酸鈉 (98%)，色譜純，USA;三聚氰胺(99.0%)，HPLC 級，F(xiàn)luka.

色譜條件:保護柱:Acclaim混合基質(zhì)WCX 1，5μm，4.3 mm ×10 mm，P/N 068354，預柱，P/N 59526;分析柱:Acclaim混合基質(zhì)WCX-1，5μm，4.6 mm ×250 mm，P/N 068352;柱溫:30℃;流動相:醋酸鹽緩沖系統(tǒng) (700 mL，10 mmol·L－1HAc 和 300 mL，10 mmol·L－1NH4Ac 混合，pH 4.3)-CH3CN(8∶2，V/V);流速:1.0 mL·min－1;進樣體積:20μL;紫外檢測器:吸收波長240 nm.

1.2 標準品溶液的制備

標準品儲備液:精密稱定100 mg的三聚氰胺，用50%甲醇水溶液定容在100 mL容量瓶中，得到三聚氰胺濃度為1000 μg·mL－1.

標準溶液:制備7份標樣用來校準，每個標樣加入一定量的標準品儲備液，醋酸水溶液流動相稀釋，三聚氰胺的濃度分別是 0.05、0.1、0.2、1.0、5.0、20 和 40 μg·m L－1.

奶粉樣品:加入1 g左右精確稱重的干燥奶粉樣品至15 mL離心管，添加10 mL水，渦流振蕩1 min后，超聲波超聲30 min.取出，滴加1 mL乙酸溶液(3%，V/V)，4℃下放置至少30 min后，離心15 min(10000 r·min－1)，移取上清液至10 mL容量瓶中，水定容至刻度，進樣前，0.2μm微孔濾膜過濾.

液體奶樣品:精確量取10 mL液體奶樣品至15 mL體積離心管后，直接加入1 mL的的乙酸(3%，V/V)洗脫液，4℃下靜置30 min.余下操作步驟同奶粉樣品處理.

奶粉和液體奶加標回收:加入40μL三聚氰胺標準品儲備液至15 mL離心管中，分別加入已精確稱定1 g左右的干燥奶粉和精確量取10 mL左右的液體奶，余下步驟同奶粉和液體奶的操作.

2 結(jié)果與討論

2.1 優(yōu)化牛奶和奶粉樣品的制備過程

一般處理牛奶和奶粉樣品分兩個步驟，樣品提取和SPE小柱凈化，50℃ N2吹干.離子交換分析法(IEX)的處理方法比此更簡便，但是只適用于液體奶檢測.因此開發(fā)一種高效而更簡便并同時處理牛奶和奶粉的方法十分必要.我們開發(fā)的方法不需要過SPE小柱和樣品干燥，只需加入乙酸洗脫液，離心，過濾，該方法同時適用于液體奶和奶粉檢測，也適用反相離子對色譜方法(RP-PIC)分析.圖1表明，三聚氰胺檢測波長240 nm，該樣品制備方法無論使用Acclaim混合基質(zhì)WCX-1色譜柱或者RP-PIC方法的Acclaim 120 C18色譜柱，都能得到很好的三聚氰胺圖譜，目標峰無雜質(zhì)峰干擾.

圖1 牛奶樣品和牛奶樣品加標圖譜(A.Acclaim混合基質(zhì)WCX-1色譜圖;B.Acclaim 120 C18色譜圖)

2.2 優(yōu)化色譜條件

三聚氰胺是親水性成分，在經(jīng)典RP反相色譜柱(例如C18或C8)中保留較弱，大多數(shù)反相柱使用離子對試劑，流動相中添加離子對試劑，例如辛烷磺酸鹽，三聚氰胺就能很好地保留.然而，離子對試劑可能會污染固定相，會改變反相柱的保留性能，如果這根色譜柱換成其它分離方法時，可能就得不到原色譜峰.RP-PIC方法通常不適合同MS檢測器連接，因此嘗試在Acclaim混合基質(zhì)WCX-1色譜柱上分離離子化的三聚氰胺，醋酸緩沖鹽洗脫.

Acclaim混合基質(zhì)WCX-1色譜柱特性是混合硅膠基質(zhì)填料，同時具有疏水性和弱離子交換特性，流動相pH值能影響到固定相的電荷數(shù)和疏水性，當流動相pH值低于固定相羧酸根的p Ka值時，離子交換作用失活，因此疏水作用成為保留機制的主要作用.當流動相pH高于固定相p Ka值時，離子交換作用激活，因此兩種分離機制都對被分析物的保留有影響，保留時間取決于分析物特性.大量實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動相緩沖鹽pH值低于3.5或大于5.0時，三聚氰胺都沒有被很好地保留.離子交換作用是能改變帶電荷化合物在色譜柱中保留的關(guān)鍵因素，在堿性環(huán)境中流動相離子濃度增加后，三聚氰胺保留時間降低;疏水性保留特性明顯受有機相比例影響，增加有機相比例后，其它的條件(例如離子作用力、pH、溫度等)保持不變，所有種類的分子(酸、堿和中性化合物)保留時間都會提前.

針對液體奶和奶粉樣品，流動相為10 mmol·L－1醋酸銨，pH=4.3，20%MeCN.對于更復雜的樣品，應當使用更強緩沖能力的緩沖鹽溶液，同時三聚氰胺的保留時間提前，而減少流動相中乙腈的比例不大可能恢復原來的保留時間位置.

2.3 色譜性能

圖2為三聚氰胺標準品溶液5次連續(xù)進樣色譜圖，每次進樣20μg·mL－1，保留時間和峰面積重復性良好.三聚氰胺標準曲線由7個不同濃度的標準品溶液制得，每個標準液重復進樣5次.標準曲線和樣品定量使用外標法，如圖3，線性范圍0.05—40 μg·mL－1，線性方程為:A=0.9120C，相關(guān)系數(shù)0.9999，曲線通過原點.

圖2 5次20μg·mL－1三聚氰胺標準溶液連續(xù)進樣重疊圖

圖3 三聚氰胺標準曲線

重復性方法學考察通過10次連續(xù)進樣1μg·mL－1標準品溶液.保留時間RSD為0.037，峰面積的RSD為0.472.三聚氰胺檢測限MDL計算公式:式中，S=重復分析標準差，n=重復次數(shù)，t(n－1，1－α=0.99)=置信度99%、自由度 n－1的Student's t值.1 μg·mL－1標準品溶液重復進樣10 次計算的檢測限 MDL 為0.015 μg·mL－1.

2.4 樣品分析

取5份樣品，包括3份奶粉(1#—3#)和2份液體奶(4#和5#)，用新前處理方法和WCX色譜法進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1#樣品中沒有檢測到三聚氰胺，而其它5份樣品都檢測到了三聚氰胺.圖4顯示了所有色譜圖.另在1#和4#樣品處理前加標樣三聚氰胺，結(jié)果兩個樣品出現(xiàn)了明顯的三聚氰胺色譜峰.

圖4 色譜圖 (A.奶粉1#— 3#;B.液體奶4#和5#)

2.5 樣品制備和分析方法的對比

取3份奶粉樣品，1#—3#，和另外3份奶粉樣品6#—8#，分別使用我們的新方法和活化SPE小柱的奶粉檢測方法(GB/T 22388 2008)，制備后的樣品分別用Acclaim 120 C18色譜柱、GB/T 22388 2008色譜條件分析方法A和Acclaim混合基質(zhì)WCX-1色譜柱、以上述色譜條件分析分析方法B，結(jié)果見表1.全部樣品結(jié)果包括兩種樣品制備過程和兩種色譜方法的分析，數(shù)據(jù)對比表明，全部6份樣品使用這兩種樣品制備方法或色譜分離方法后，結(jié)果一致性良好.

表1 牛奶樣品檢測結(jié)果對比(mg·kg－1)

對于復雜基質(zhì)的奶制品可能有三聚氰胺假陽性，與三聚氰胺標準品溶液對比紫外光譜圖是有效的辦法.分析樣品8#時，分別使用GB/T 22388 2008中的樣品制備方法和混合基質(zhì)WCX-1色譜柱方法，發(fā)現(xiàn)一個和三聚氰胺保留時間接近的小峰，將此峰標記為三聚氰胺時濃度為3.3 mg·kg－1.使用其它樣品處理方法和色譜方法沒有在該樣品中檢測到三聚氰胺.在VWD紫外檢測器后連接一個PDA陣列檢測器，對比紫外光譜圖，如圖5中所示，結(jié)果顯示該色譜峰不是三聚氰胺，使用PDA陣列檢測器分析有助于減少三聚氰胺假陽性誤判.

圖5 UV光譜圖(A.三聚氰胺標準溶液;B.假定的三聚氰胺色譜峰)

3 結(jié)論

本文開發(fā)了一個快速處理檢測液體奶和奶粉樣品中三聚氰胺的高效簡便方法.方法使用Acclaim混合基質(zhì)WCX-1色譜柱和醋酸銨緩沖鹽與乙腈為流動相的分析方法進行檢測，三聚氰胺得到很好地保留，并可同時兼容MS檢測器.