闞歆，張瀟云，王哲，董潔，王蒙蒙，胡國新

(1.溫州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院分子毒理與藥理研究所，浙江溫州325035;2.溫州市第三人民醫(yī)院藥劑科，浙江溫州325000)

甲氧滴滴涕及其代謝產(chǎn)物2，2-二(4-羥基苯基)-1，1，1-三氯乙烷在大鼠體內(nèi)的毒代動力學(xué)

闞歆1，2，張瀟云1，王哲1，董潔1，王蒙蒙1，胡國新1

(1.溫州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院分子毒理與藥理研究所，浙江溫州325035;2.溫州市第三人民醫(yī)院藥劑科，浙江溫州325000)

目的探討甲氧滴滴涕(MXC)及其代謝產(chǎn)物2，2-二(4-羥基苯基)-1，1，1-三氯乙烷(HPTE)在大鼠體內(nèi)的毒代動力學(xué)。方法雄性SD大鼠單次ig給予MXC 500 mg·kg－1染毒后，于不同時間點收集血液樣本。應(yīng)用高效液相色譜-紫外法測定大鼠血漿中MXC和HPTE的含量，用DAS 2.0軟件的房室模型進行擬合，計算代謝動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果MXC的毒代動力學(xué)參數(shù)血漿最大濃度(cmax)為(5.52±1.21)mg·L－1;分布半衰期(t1/2α)為(4.12±1.21)h;消除半衰期(t1/2β)為(22.54±6.31)h;曲線下面積〔AUC(0－t)〕為(65.97±17.94)mg·h·L－1;AUC(0－∞)為(69.06±18.61)mg·h·L－1;清除率(Cl)為(7.94±2.31)L·h－1·kg－1;和表觀分布容積(V)為(66.16±20.21)L·kg－1。代謝產(chǎn)物HPTE的毒代動力學(xué)參數(shù)cmax為(1.32±0.37)mg·L－1，t1/2α為(3.13±0.91)h;t1/2β為(31.12±10.91)h，AUC(0－t)為(14.69±2.99)mg·h·L－1，AUC(0－∞)為(17.23±3.66)mg·h·L－1，Cl為(30.14±6.09)L·h－1·kg－1，V為(232.55±36.44)L·kg－1。結(jié)論MXC及其代謝產(chǎn)物HPTE的毒代動力學(xué)均符合二室模型。MXC和HPTE的清除半衰期均較長，易發(fā)生體內(nèi)蓄積。

甲氧滴滴涕;2，2-二(4-羥基苯基)-1，1，1-三氯乙烷;毒代動力學(xué)

甲氧滴滴涕(甲氧氯，methoxychlor，MXC)化學(xué)名為1，1，1-三氯-2，2-二對甲氧苯基乙烷，屬有機氯殺蟲劑，其較之滴滴涕毒性低并且容易降解，故而用來取代滴滴涕廣泛用于保護水果、莊稼、蔬菜和宅園。MXC主要通過食物鏈途徑進入人體［1］。在體內(nèi)，MXC會轉(zhuǎn)變成為2-(4-羥基苯基)-2-(4-甲氧基苯基)-1，1，1-三氯乙烷和2，2-二(4-羥基苯基)-1，1，1-三氯乙烷〔2，2-bis-(phydroxyphenyl)-1，1，1-trichloroethane，HPTE〕［2］。近年來，MXC及其代謝產(chǎn)物HPTE的毒性作用不斷被發(fā)現(xiàn)，其涉及機體神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)等，其中生殖系統(tǒng)的毒性尤為突出［3］。并且發(fā)現(xiàn)HPTE具有比MXC更強的生殖毒性［4］，從而受到越來越多的重視。目前，MXC的檢測方法以及毒代動力學(xué)(簡稱毒動學(xué))研究國內(nèi)外已有文獻報道［5－8］，但HPTE的毒動學(xué)研究目前未見報道。

本研究采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)-紫外法同時檢測大鼠血漿中MXC及其代謝物HPTE的濃度，并研究二者在大鼠體內(nèi)的毒動學(xué)過程，為研究MXC以及HPTE在動物體內(nèi)代謝奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

MXC標(biāo)準(zhǔn)品，純度95%，購自Sigma公司。HPTE標(biāo)準(zhǔn)品由Monsanto公司W(wǎng)R KELCE教授提供;氯硝西泮購自中國藥品生物制品檢定所，批號171227200802;乙腈色譜純，批號1434430822，購自Merck公司。

1100系列高效液相色譜儀，包括G1311A四元泵，G1379A在線脫氣機，G1316A柱溫箱，G1314A VWD檢測器和G1328B手動進樣器和化學(xué)工作站(美國Agilent公司);AB204-A電子分析天平(梅特勒-托利多上海儀器公司);XW-80型旋渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠);TGL-16G型高速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);SYZ-550型石英亞沸高純水蒸餾器(江蘇金壇市丹陽門石英玻璃廠)。

1.2 動物

SD大鼠8只，雄性，體質(zhì)量250～280 g。由溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK(滬)2007-0005。

1.3 高效液相色譜條件

色譜柱XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm);流動相為A:H2O，B:乙腈;二元梯度洗脫程序:0 min時A∶B(55∶45)，6 min時A∶B(15∶85)，8 min時A∶B(55∶45)，流速1.0 ml·min－1;紫外檢測波長:240 nm;柱溫:30℃。

1.4 動物給藥及生物樣品的收集

大鼠8只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，染毒前禁食12 h。MXC用玉米油溶解，一次性ig給予MXC 500 mg·kg－1染毒。分別于染毒前和染毒后5，10，20 min，1，2，4，4.5，5，5.5，6，6.5，8，12，24，36和48 h尾靜脈取血0.3 ml;注入肝素化的試管，2898×g離心10 min，取血漿，－65℃保存?zhèn)錅y。

1.5 血漿樣品的預(yù)處理

取血漿樣品100 μl注入1.5 ml EP管中，加入內(nèi)標(biāo)氯硝西泮15 mg·L－1工作液10 μl，混勻后加入乙腈150 μl，混旋1 min后，14 489×g離心10 min，取上清液，20 μl進樣檢測。操作過程盡量避光，處理好的樣本及時檢測。

1.6 MXC及HPTE標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取空白血漿180 μl置于帶蓋的1.5 ml EP管中，分別加入MXC和HPTE系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各20 μl，搖勻，使樣品中MXC血漿濃度分別為0.06，0.12，0.3，0.6，1.2，3，6和12 mg·L－1，HPTE血漿濃度分別為0.06，0.12，0.2，0.3，0.6，1.2，2和3 mg·L－1，按1.5項的方法預(yù)處理后，記錄色譜圖及峰面積，分別以MXC及HPTE的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為橫坐標(biāo)，MXC及HPTE的濃度為縱坐標(biāo)進行線性回歸，計算出校正標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.7 MXC及HPTE在血漿中回收率和精密度考察

分別配制MXC 0.12，0.6和6 mg·L－1，HPTE分別為0.12，0.3和2 mg·L－1的質(zhì)控血漿樣品各5份。按1.5項處理后，記錄檢測量，以檢測量與加入量之比計算相對回收率;以血漿標(biāo)準(zhǔn)的峰面積與該濃度純標(biāo)峰面積之比計算絕對回收率。精密度用日內(nèi)和日間變異表示。以各濃度分別在同日測定5次，記錄檢測量，計算日內(nèi)變異系數(shù)。再按以上測定方法每日測定1次，連續(xù)5 d重復(fù)測定，記錄檢測量，計算日間變異。

1.8 MXC及HPTE在血漿中穩(wěn)定性考察

配制MXC濃度分別為0.12，0.6和6 mg·L－1，HPTE濃度分別為0.12，0.3和2 mg·L－1的質(zhì)控血漿樣品各7份，其中4份在室溫下放置0，3，6和12 h后再經(jīng)血漿樣品處理方法處理后進樣檢測，記錄結(jié)果。另外3份分別在－65℃冰箱冰凍保存1，2和4周后，再經(jīng)血漿樣品處理方法處理后進樣檢測，記錄結(jié)果?？疾焓覝胤胖煤捅鶅霰４嫜獫{樣品的穩(wěn)定性;同時取3種濃度的MXC和HPTE血漿樣品置于－65℃冰箱中，于2，4和6 h取出反復(fù)凍融，測定MXC和HPTE的含量。考察其凍融穩(wěn)定性。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MXC及HPTE的高效液相方法學(xué)確證

圖1顯示，血漿中MXC，HPTE和內(nèi)標(biāo)物氯硝西泮的峰形良好，分離完全，無雜質(zhì)峰干擾。MXC，HPTE和內(nèi)標(biāo)氯硝西泮的保留時間分別為8.2，4.3和3.3 min。MXC的校正標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=2.2045X+0.0107(r=0.9998)，HPTE的校正標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=2.8744X－0.0284(r=0.9997)。血漿MXC及HPTE的定量下限均為0.06 mg·L－1。

圖1 甲氧滴滴涕(MXC)及其代謝產(chǎn)物2，2-二(4-羥基苯基)-1，1，1-三氯乙烷(HPTE)在大鼠血漿中的高效液相色譜分離圖.A:空白血漿;B:空白血漿加MXC，HPTE對照品和內(nèi)標(biāo)氯硝西泮;C:血漿樣品.峰1:氯硝西泮;峰2:HPTE;峰3:MXC.Fig.1 HPLC chromatograms of methoxychlor(MXC)and its metabolite 2，2-bis-(p-hydroxyphenyl)-1，1，1-trichloroethane(HPTE)in plasma of rats.

表1 MXC在血漿中的回收率、精密度和穩(wěn)定性Tab.1 Recovery，precision and stability of MXC in plasma of rats

表2 HPTE在血漿中的回收率、精密度和穩(wěn)定性Tab.2 Recovery，precision and stability of HPTE in plasma of rats

由表1和表2所示，MXC 0.12，0.6和6 mg·L－1和HPTE 0.12，0.3和2 mg·L－1血漿標(biāo)準(zhǔn)品的回收率均大于85%，精密度均小于10%。MXC 0.12，0.6和6 mg·L－1和HPTE 0.12，0.3和2 mg·L－1血漿標(biāo)準(zhǔn)品室溫放置0，3，6，12 h和－65℃冰凍保存1，2和4周后考察穩(wěn)定性，MXC和HPTE三個濃度的變異系數(shù)均小于10%;反復(fù)凍融3次后，MXC三個濃度的變異系數(shù)均＜6.23%，HPTE三個濃度的變異系數(shù)均＜5.34%。方法學(xué)驗證結(jié)果符合生物樣品分析指導(dǎo)原則的要求。方法具有較高的專屬性。

2.2 MXC及其代謝產(chǎn)物HPTE毒動學(xué)

圖2 MXC和HPTE的平均血漿濃度-時間曲線.大鼠一次性ig染毒MXC 500 mg·kg－1.分別于染毒前和染毒后5，10，20 min，1，2，4，4.5，5，5.5，6，6.5，8，12，24，36和48 h尾靜脈取血.高效液相色譜法測定血藥濃度.±s，n=8.Fig.2 Concentration-time curves of MXC and HPTE in plasma after MXC 500 mg·kg－1was ig given in rats.

大鼠ig給予MXC染毒后，MXC及其代謝產(chǎn)物HPTE的濃度-時間曲線如圖2所示;經(jīng)DAS2.0程序自動擬合，MXC與HPTE的毒動力學(xué)均符合二室模型，計算求得主要毒動學(xué)參數(shù)(表3)。MXC吸收及消除較慢，達到血漿最大濃度(cmax)5.52 mg·L－1需5.63 h，消除半衰期(t1/2β)長達(22.54±6.31)h;同時表觀分布容積(V)較大，為(66.16±20.21)L·kg－1，說明MXC在血管外組織有廣泛分布。HPTE的cmax顯著低于原型藥物MXC，但達峰時間與MXC相近，為(5.81±0.46)h，t1/2β也較MXC長，為(31.12±10.91)h;HPTE的V高達(232.55±36.44)L·kg－1，提示其體內(nèi)分布很廣，甚至有特異性組織分布的可能。

表3 MXC和HPTE的主要毒動學(xué)參數(shù)Tab.3 Toxicokinetic parameters of MXC and HPTE

3 討論

目前已報道的MXC的檢測方法主要為氣相色譜法［5］和氣質(zhì)聯(lián)用法［6］等，其靈敏度高且能同時分辨多種農(nóng)藥，但儀器和試劑的成本也大，樣品的前期處理復(fù)雜，對實驗條件的要求較高。因此本研究建立HPLC檢測法，以乙腈-水作為流動相，采用梯度洗脫來縮短MXC與HPTE兩者過長的保留時間差，使MXC與HPTE的保留時間分別提前至8.19和4.26 min，并能與內(nèi)標(biāo)氯硝西泮很好地分離。血樣預(yù)處理方法在不影響MXC和HPTE正常出峰，以及定量下限滿足要求的前提下，選擇更為省時易行的有機溶劑乙腈沉淀法。建立的方法經(jīng)濟、快速簡便，靈敏準(zhǔn)確，可用于同時檢測血漿樣品中MXC及其代謝物HPTE的濃度及進行整體動物的毒動學(xué)的研究。

MXC為低毒類農(nóng)藥，臨床未見有急性中毒的報道。但有文獻報道，羊口服放射標(biāo)記的MXC 72 h后，其腎上腺，腦，腎，心，肝等部位仍有少量MXC存在［7］。本研究中大鼠ig給予MXC 500 mg·kg－1后，t1/2β長達22.54 h，表明單次染毒后MXC在血漿消除較慢，且MXC全身分布較廣，多次染毒后有可能在體內(nèi)造成蓄積，有必要研究多次染毒后由蓄積引起的慢性毒性作用。

有研究表明，兔ig給予MXC 200 mg·kg－1后，MXC的cmax為3.6 mg·L－1［8］，t1/2β為15.12 h，雖比大鼠的t1/2β短，也說明MXC在兔體內(nèi)的消除較慢。值得關(guān)注的是，MXC在兔體內(nèi)的血漿濃度-時間曲線出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，分為0.083～4 h和4～24 h兩個時間段［8］，呈現(xiàn)出與大鼠較大的種屬差別，這可能與兔這類食草動物有其獨特的消化吸收過程有關(guān)。

體外實驗研究結(jié)果表明，HPTE對大鼠3β-羥基類固醇脫氫酶和17β-羥基類固醇脫氫酶(參與雄激素生物合成的酶)的抑制作用均為MXC的3倍以上［9］。本研究中，大鼠ig染毒MXC后20 min就能檢到代謝產(chǎn)物HPTE，于5.81 h左右達cmax，與原藥MXC的tmax非常相近，說明在體內(nèi)，MXC能較快代謝為HPTE。HPTE的cmax為1.32 mg·L－1，約為MXC的1/4，參照之前文獻［9］的報道，提示MXC進入體內(nèi)后的毒性，很大一部分是通過代謝為HPTE而發(fā)揮的;并且總體上來說，HPTE與MXC的濃度比值，有隨著時間增加而變大的趨勢，如1 h時約為1/6，5 h時約為1/5，而48 h時則約為1/3，同時HPTE的t1/2β為31.12 h，較MXC的22.54 h更長，說明體內(nèi)HPTE消除較MXC慢。因此，在研究MXC毒性時，HPTE所起的作用不容忽視。為了更好地了解MXC和HPTE的毒性及相互關(guān)系，有必要進一步研究二者在體內(nèi)各組織的分布、毒性的差異及體內(nèi)暴露濃度與毒性之間的關(guān)系。

［1］侯蕾，陳必良.甲氧滴滴涕的生殖毒性及研究進展［J］.中國婦幼健康研究，2007，(5):415-418.

［2］Nyagode BA，James MO，Kleinow KM.Influence of dietary coexposure to benzo(a)pyrene on the biotransformation and distribution of14C-methoxychlor in the channel catfish(Ictalurus punctatus)［J］.Toxicol Sci，2009，108(2):320-329.

［3］劉伏祥.甲氧滴滴涕的毒性作用及其機制研究進展［J］.解剖學(xué)雜志，2007，30(3):373-375.

［4］Gupta RK，Aberdeen G，Babus JK，Albrecht ED，F(xiàn)laws JA.Methoxychlor and its metabolites inhibit growth and induce atresia of baboon antral follicles［J］.Toxicol Pathol，2007，35(5):649-656.

［5］夏俊鵬，吳飛，劉紅亞.工作場所空氣中甲氧滴滴涕的氣相色譜測定方法研究［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2007，17(4):588-589，600.

［6］胡小鐘，儲曉剛，余建新，李晶，黃鑫，林雁飛，等.基質(zhì)固相分散和氣相色譜-質(zhì)譜法測定濃縮蘋果汁中22種有機氯農(nóng)藥和15種擬除蟲菊酯農(nóng)藥的殘留量［J］.分析測試學(xué)報，2004，23(5):38-42，47.

［7］Agency for Toxic Substances and Disease Registry.Toxicological Profile for Methoxychlor［M/DL］.［2010-05-15］∥http://www.atsdr.cds.gov/toxprofiles/tp.asp?id=778＆tid/151

［8］周紅宇，肖仲祥，張馨，王萍，胡國新.高效液相色譜法檢測兔血漿中甲氧滴滴涕的濃度［J］.溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，40(4):392-394.

［9］Hu GX，Zhao B，Chu Y，Li XH，Akingbemi BT，Zheng ZQ，et al.Effects of methoxychlor and 2，2-bis(p-hydroxyphenyl)-1，1，1-trichloroethane on3βhydroxysteroid dehydrogenase and 17β-hydroxysteroid dehydrogenase-3 activities in human and rat testes［J］.Int J Androl，2010，33:1-7

Toxicokinetics of methoxychlor and its metabolite 2，2-bis-( p-hydroxyphenyl) -1，1，1-trichloroethane in rats

KAN Xin1，2，ZHANG Xiao-yun1，WANG Zhe1，DONG Jie1，WANG Meng-meng1，HU Guo-xin1

(1.Institute of Molecular Toxicology and Pharmacology，Pharmacy School，Wenzhou Medical College，Wenzhou325035，China;2.Pharmacy Department，Wenzhou Third People's Hospital，Wenzhou325000，China)

OBJECTIVETo explore toxicokinetics of methoxychlor(MXC)and its metabolite 2，2-bis-(p-hydroxyphenyl)-1，1，1-trichloroethane(HPTE)in rats.METHODSEight male SD rats were ig given MXC 500 mg·kg－1and plasma was collected at different time points before and after administration.MXC and HPTE concentrations in the plasma were determined by high performance liquid chromatography.The compartment model was fitted and toxicokinetic parameters were calculated by DAS 2.0 software.RESULTSThe toxicokinetic parameters of MXC were as follows:cmaxwas(5.52±1.21)mg·L－1;t1/2αwas(4.12±1.21)h;t1/2βwas(22.54±6.31)h;AUC(0－t)was(65.97±17.94)mg·h·L－1;AUC(0－∞)was(69.06±18.61)mg·h·L－1;Cl was(7.94±2.31)L·h－1·kg－1;and V was(66.16±20.21)L·kg－1.The toxicokinetic parameters of HPTE were as follows:cmaxwas(1.32±0.37)mg·L－1;t1/2αwas(3.13±0.91)h;t1/2βwas(31.12±10.91)h;AUC(0－t)was(14.69±2.99)mg·h·L－1;AUC(0－∞)was(17.23±3.66)mg·h·L－1;Cl was(30.14±6.09)L·h－1·kg－1;and V was(232.55±36.44)L·kg－1.CONCLUSIONThe toxicokinetic profiles of MXC and HPTE in rats are both fitted to two-compartment model.MXC and HPTE may be accumulated easily due to their longer half-life clearance time.

methoxychlor;2，2-bis-(p-hydroxyphenyl)-1，1，1-trichloroethane;toxicokinetics

The project supported by the Key Foster Program in Medicine of Zhejiang Province(07F-04);and by National Natural Science Foundation of China(81102092)

HU Guo-xin，E-mail:wzhhgx@yahoo.com.cn，Tel:13506660881

R99

A

1000-3002(2011)05-0474-05

10.3867/j.issn.1000-3002.2011.05.011

浙江省醫(yī)學(xué)扶植重點建設(shè)學(xué)科計劃(07F-04);國家自然青年科學(xué)基金項目(81102092)

闞歆(1984－)，女，碩士研究生，主要從事臨床藥理學(xué)與毒理學(xué)研究。胡國新(1957－)，男，教授，主要從事臨床藥理學(xué)與毒理學(xué)研究。

胡國新，E-mail:wzhhgx@yahoo.com.cn，Tel:13506660881

2010-08-26接受日期:2010-12-20)

(本文編輯:付良青)