馬芳，熊華偉，賈小芳，姚亞敏，劉曉茜，張麗軍，3

(1.上海市公共衛(wèi)生臨床中心科學(xué)研究部，上海201508;2.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院生物科學(xué)系，江西南昌330031;3.中南大學(xué)臨床藥理研究所，湖南長沙410083)

依非韋倫的肝細(xì)胞毒性作用及對蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響

馬芳1，熊華偉2，賈小芳1，姚亞敏1，劉曉茜1，張麗軍1，3

(1.上海市公共衛(wèi)生臨床中心科學(xué)研究部，上海201508;2.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院生物科學(xué)系，江西南昌330031;3.中南大學(xué)臨床藥理研究所，湖南長沙410083)

目的探討依非韋倫對肝細(xì)胞的毒性作用及對蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響。方法人肝癌細(xì)胞系Huh7中分別加入依非韋倫1.25，2.5，5和10 mg·L－1，培養(yǎng)5 h后采用原位比色法測定細(xì)胞內(nèi)活性氧類(ROS)的含量;依非韋倫2.5 mg·L－1與細(xì)胞作用5 h后，用膜聯(lián)蛋白-Ⅴ/碘化丙啶細(xì)胞凋亡檢測試劑盒染色。用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡;依非韋倫2.5 mg·L－1處理細(xì)胞5 h，獲得全細(xì)胞蛋白質(zhì)進(jìn)行二維凝膠電泳，采用Image Master軟件分析差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，應(yīng)用納升級液相色譜串聯(lián)電噴霧離子阱質(zhì)譜進(jìn)行差異蛋白質(zhì)鑒定。結(jié)果隨著依非韋倫濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)ROS的含量逐步升高(r=0.9740，P＜0.05)。依非韋倫2.5 mg·L－1與細(xì)胞作用5 h后，與正常對照組比較，細(xì)胞凋亡百分率無顯著變化，但有7種蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著降低，其中線粒體熱激蛋白75和抗氧化蛋白1的表達(dá)量分別降低了76.7%和85.5%;抗胰蛋白酶及其S突變體、細(xì)胞角蛋白9、剪接體相關(guān)蛋白和磷酸丙糖異構(gòu)酶的表達(dá)被完全抑制。結(jié)論依非韋倫對Huh7細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性，可能通過調(diào)節(jié)熱激蛋白75和抗氧化蛋白1等的表達(dá)影響線粒體的功能，最終導(dǎo)致肝毒性的發(fā)生。

依非韋倫;肝細(xì)胞;毒性;活性氧類;蛋白質(zhì)組學(xué)

依非韋倫(efavirenz，EFV)是一種在抗艾滋病治療中廣泛使用的非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。目前臨床上推薦使用的劑量是每天單次口服600 mg，從而可達(dá)到藥物的有效濃度1～4 mg·L－1［1］。雖然臨床結(jié)果表明，EFV與其他抗艾滋病一線治療藥物相比具有相對較高的安全性，但不良反應(yīng)時(shí)有發(fā)生，包括皮膚反應(yīng)、神經(jīng)系統(tǒng)病變及肝毒性［2］。在一項(xiàng)接受EFV抗病毒治療的312名艾滋病患者的研究中發(fā)現(xiàn)，EFV引起的嚴(yán)重肝中毒的發(fā)生率高達(dá)8%;但在這些嚴(yán)重肝中毒的發(fā)生病例中，只有50%艾滋病患者在服藥12周內(nèi)，可通過檢測血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶或谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平及時(shí)判斷嚴(yán)重肝中毒，另外50%的肝中毒患者則在12周之后才可做出判斷［3－4］，表明EFV相關(guān)的嚴(yán)重肝毒性的早期觀察和診斷仍缺乏較好的標(biāo)志物。Ena等［5］研究表明，在服用EFV并存在以下因素之一時(shí)，EFV導(dǎo)致的嚴(yán)重肝毒性的發(fā)生率升高，這些因素包括丙肝病毒感染、酗酒和聯(lián)合使用蛋白酶抑制劑。

研究表明，細(xì)胞線粒體功能的紊亂是許多藥物引起肝毒性的重要機(jī)制，而線粒體功能失調(diào)可由細(xì)胞內(nèi)活性氧類(reactive oxygen species，ROS)的升高引起［6－7］。因此，細(xì)胞內(nèi)ROS的升高可作為判斷肝毒性發(fā)生的指標(biāo)之一。目前，對EFV導(dǎo)致肝毒性的研究僅局限于測定谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶等酶活性的改變，尚未從細(xì)胞蛋白質(zhì)組水平探討EFV對細(xì)胞蛋白質(zhì)整體表達(dá)水平的改變，從而明確該藥物對肝細(xì)胞總蛋白表達(dá)的影響。本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，探討EFV對肝細(xì)胞的毒性作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥品、試劑和儀器

人肝癌細(xì)胞系Huh7，由復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院袁正宏教授惠贈。EFV口服片，購自澳大利亞默沙東制藥公司，用甲醇溶解磨碎成粉末［5］，配成EFV 10 g·L－1的甲醇溶液，用0.22 μm濾器過濾除去未溶解的輔料及雜質(zhì)，4℃儲存?zhèn)溆茫褂脮r(shí)用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)稀釋至適當(dāng)濃度。DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素和胎牛血清，均購自美國Gibco公司;甲醇，購自國藥集團(tuán);GENMED細(xì)胞氧化應(yīng)激ROS定量檢測試劑盒，購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司;膜聯(lián)蛋白-Ⅴ/碘化丙啶細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;蛋白質(zhì)快速定量試劑盒，購自美國Bio-Rad公司。CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo公司;倒置顯微鏡，日本Olympus公司;穩(wěn)壓電源和垂直平板電泳系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司;納升級液相色譜Ultimate 3000(包括C18預(yù)柱和C18反向柱)，購自美國戴安公司;高容量離子阱HCT質(zhì)譜儀，購自德國Bruker Daltonics公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞Huh7在含青霉素200 kU·L－1，鏈霉素100 mg·L－1的完全培養(yǎng)基中于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的Huh7細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為3×107L－1，接種于96孔板中或10-cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 ROS含量檢測

按上述方法將細(xì)胞接種于96孔板中并培養(yǎng)至約85%細(xì)胞融合后，將完全培養(yǎng)基更換成含EFV終濃度分別為1.25，2.5，5和10 mg·L－1的完全培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h，按照GENMED ROS原位比色法定量檢測試劑盒所述步驟進(jìn)行ROS的定量檢測:染色液染色4 h，固著液固定2次，空氣中晾干后用溶解液充分溶解后，使用酶標(biāo)儀測定濃度650 nm的吸光度值(absorbance，A)。藥物處理組細(xì)胞ROS相對含量的計(jì)算參考文獻(xiàn)［7］進(jìn)行，ROS相對含量(%)=(A藥物/A正常對照)×100%。

1.4 細(xì)胞凋亡百分率檢測

按上述方法將細(xì)胞接種于6孔板中并培養(yǎng)至85%細(xì)胞融合，將完全培養(yǎng)基換成含EFV終濃度為2.5 mg·L－1的培養(yǎng)基，設(shè)3個復(fù)孔，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h，用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞后按照膜聯(lián)蛋白-Ⅴ/碘化丙啶雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒進(jìn)行細(xì)胞染色，最后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡百分率。

1.5 細(xì)胞全蛋白質(zhì)的提取、定量和二維凝膠電泳分離

細(xì)胞在生長至約85%細(xì)胞融合后，移除完全培養(yǎng)基，用EFV 2.5 mg·L－1的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)5 h后，PBS洗細(xì)胞2次，向培養(yǎng)皿中加入細(xì)胞裂解液(含尿素8 mol·L－1，硫脲2 mol·L－1，4%CHAPS，1%NP-40，1%DNA酶)，用細(xì)胞鏟收集細(xì)胞，離心收集上清即得細(xì)胞蛋白質(zhì)。用蛋白質(zhì)快速定量試劑盒對提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，對照組和EFV 2.5 mg·L－1組各500 μg蛋白質(zhì)樣品同時(shí)在20℃自動進(jìn)行18 cm IPG干膠條水化和聚焦，聚焦時(shí)間為6 h。等電聚焦結(jié)束后，將膠條進(jìn)行兩步平衡，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度為13.5%;最后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。每組樣品重復(fù)3次。

1.6 差異蛋白分析和質(zhì)譜鑒定

采用Image Master軟件分析差異蛋白質(zhì)，膠中切取差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，脫色脫水凍干后，每管加入約5 μl胰酶(0.02 g·L－1)，37℃酶解過夜。酶切后肽段先經(jīng)C18預(yù)柱脫鹽，再經(jīng)C18反向柱進(jìn)行分離，分離的肽段由納流噴針進(jìn)入HCT質(zhì)譜進(jìn)行實(shí)時(shí)的離子化分析檢測。用Data Analysis 3.2軟件整合肽指紋圖譜和串聯(lián)質(zhì)譜二級圖譜，通過Mascot軟件查詢NCBI數(shù)據(jù)庫。所有的蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定結(jié)果均經(jīng)過人工檢查，每個蛋白質(zhì)至少有一條肽段同時(shí)檢測到3個或3個以上連續(xù)的y離子或b離子。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 EFV對人肝癌細(xì)胞Huh7 ROS含量的影響

如表1所示，與正常對照組相比，EFV 1.25，2.5，5和10 mg·L－1組細(xì)胞ROS含量均明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)，且具有濃度依賴關(guān)系(r=0.9740，P＜0.05)。

表1 依非韋倫(EFV)對人肝癌細(xì)胞Huh7細(xì)胞內(nèi)活性氧類(ROS)含量的影響Tab.1 Effect of efavirenz(EFV)on content of reactive oxygen species(ROS)in Huh7 cells

2.2 EFV對人肝癌細(xì)胞Huh7凋亡率的影響

圖1流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，EFV 2.5 mg·L－1與Huh7細(xì)胞作用5 h，與正常對照組比較，細(xì)胞凋亡率無明顯變化。EFV 2.5 mg·L－1組細(xì)胞凋亡率為(22.5±3.4)%，正常對照組為(19.7±5.1)%，無顯著性差異(n=3，P=0.475)。

圖1 EFV 2.5 mg·L－1與Huh7細(xì)胞作用5 h對細(xì)胞凋亡率的影響.A:正常對照組;B:EFV 2.5 mg·L－1.Fig.1 Effect of EFV 2.5 mg·L－1on cell apoptosis incubating with Huh7 cells for 5 h.

2.3 EFV對人肝癌細(xì)胞Huh7蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響

將正常對照組和EFV 2.5 mg·L－1組細(xì)胞的全蛋白質(zhì)進(jìn)行二維凝膠電泳，對電泳膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。ImageMaster軟件分析鑒定結(jié)果表明，EFV組和對照組分別有733±75和764±104個蛋白質(zhì)點(diǎn)(n=3)。選擇二維凝膠電泳分離效果好、點(diǎn)數(shù)多的一塊膠作為參考膠，進(jìn)行平行組間的匹配分析，篩選表達(dá)量差異在2倍及其以上的差異蛋白，共識別了7個差異蛋白(圖2)，將其編號為1～7號。其中1號蛋白質(zhì)點(diǎn)(圖3)膠內(nèi)校正后的平均灰度值，EFV組與正常對照組比較下降了76.7%。

圖2 EFV 2.5 mg·L－1對Huh7細(xì)胞差異表達(dá)蛋白影響的二維凝膠電泳.圖中圓圈畫出的蛋白質(zhì)點(diǎn)為經(jīng)過Image Master軟件分析表達(dá)差異在2倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn).A:正常對照組;B:EFV 2.5 mg·L－1.Fig.2 Profiles of two-dimensional gel electrophoresis on differently expressed proteins in Huh7 cells for effect of EFV 2.5 mg·L－1.

圖3 1號蛋白質(zhì)點(diǎn)在正常對照組(A)和EFV 2.5 mg·L－1組(B)中的差異表達(dá).箭頭所指為1號蛋白質(zhì)點(diǎn)的位置.1－3:分別表示3次重復(fù)實(shí)驗(yàn).Fig.3 Different expression of No.1 protein spot between normal control(A)and EFV 2.5 mg·L－1(B)treated cells.

2.4 EFV引起人肝癌細(xì)胞Huh7差異表達(dá)蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定及分析

將經(jīng)過圖像分析確定的7個差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行取點(diǎn)、脫色和胰酶酶解后，經(jīng)過液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析，獲得的肽片段的質(zhì)荷比(m/z)輸入Mascot查詢系統(tǒng)，檢索NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。如果Mascot分?jǐn)?shù)＞45則認(rèn)為得到鑒定，否則視為未得到鑒定。圖4為1號蛋白質(zhì)點(diǎn)的Mascot搜索結(jié)果的得分示意圖，顯示1號蛋白質(zhì)點(diǎn)得到陽性鑒定。圖5顯示1號蛋白質(zhì)點(diǎn)的匹配肽段和二級質(zhì)譜圖，圖中可見質(zhì)譜檢測到該肽段9個連續(xù)的y離子:y4，y5，y6，……，y12，表明該肽段的鑒定非常準(zhǔn)確。結(jié)合蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和相對分子質(zhì)量的信息，將1號蛋白質(zhì)點(diǎn)鑒定為線粒體熱休克蛋白75。另外6個差異點(diǎn)的分析類似1號蛋白質(zhì)點(diǎn)，鑒定結(jié)果見表2。其中線粒體熱休克蛋白75和抗氧化蛋白1在EFV 2.5 mg·L－1組表達(dá)量分別下降76.7%和85.5%，而其余5個蛋白質(zhì)則是在對照組中有表達(dá)，而在EFV 2.5 mg·L－1組中未檢測到表達(dá)。

圖4 1號蛋白質(zhì)點(diǎn)的Mascot得分.得分超出陰影區(qū)表明得到陽性鑒定(P＜0.05)，1號蛋白質(zhì)點(diǎn)的Mascot得分是624分.Fig.4 Mascot score of No.1 protein spot.

圖5 線粒體熱激蛋白75的質(zhì)譜鑒定的序列覆蓋率和二級質(zhì)譜圖.A:蛋白質(zhì)序列，帶下劃線的序列為通過HCT質(zhì)譜檢測到的氨基酸序列;B:肽段EQQIVIQSSGGLSK的酶切肽段二級質(zhì)譜圖，該肽段在線粒體熱休克蛋白序列中的位置在A中以粗體表示.Fig.5 Sequence coverage of mitochondrial heat shock protein 75 and MS/MS spectrum of peptide(EQQIVIQSSGGLSK)from it.

表2 鑒定EFV 2.5 mg·L－1作用Huh7細(xì)胞5 h表達(dá)的差異蛋白Tab.2 Differential proteins between EFV 2.5 mg·L－1treated Huh7 cells and untreated control cells

3 討論

EFV作為一種臨床一線使用的抗艾滋病藥物，其廣泛和長期使用勢必需要對其毒性進(jìn)行全面的評估。本研究發(fā)現(xiàn)，EFV 2.5 mg·L－1對肝細(xì)胞凋亡無明顯影響，但可使肝毒性指標(biāo)——細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯升高。通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法檢測EFV 2.5 mg·L－1作用后的肝細(xì)胞Huh7蛋白質(zhì)表達(dá)譜的改變，結(jié)果表明7種蛋白表達(dá)明顯降低，分別是線粒體熱激蛋白75、抗胰蛋白酶及其S突變體、細(xì)胞角蛋白9、剪接體相關(guān)蛋白、磷酸丙糖異構(gòu)酶和抗氧化蛋白1。

肝細(xì)胞內(nèi)線粒體熱激蛋白75和抗氧化蛋白1是與細(xì)胞應(yīng)激相關(guān)的蛋白。線粒體熱激蛋白75是一種定位在線粒體受葡萄糖調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)，具備普遍性和保守性，可通過抗氧化作用、協(xié)同免疫作用和抗細(xì)胞凋亡途徑發(fā)揮作用，使細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)從而保護(hù)細(xì)胞［8］?？寡趸鞍?也定位在線粒體，能調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的抗氧化功能，對線粒體自穩(wěn)態(tài)的維持發(fā)揮重要作用［9］，它的異常表達(dá)會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［10］。在對空氣中常見的一種污染物——丙烯醛的毒性研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在丙烯醛5 μmol·L－1暴露30 min后，抗氧化蛋白1抗氧化活性被抑制85%以上，并且這種抑制作用具有濃度依賴關(guān)系，同時(shí)該蛋白的活性在消除丙烯醛刺激4 h后仍然不能恢復(fù)，表明丙烯醛對該蛋白活性的抑制是不可逆的［11］。在細(xì)胞凋亡過程中，抗氧化蛋白1的缺失導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)超氧化物H2O2水平的升高，這種超氧化物的增多反過來又抑制線粒體的功能，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，在EFV作用下來源于線粒體的熱激蛋白75和抗氧化蛋白1的表達(dá)量顯著下降，為研究EFV肝毒性早期細(xì)胞蛋白質(zhì)的變化以及線粒體功能紊亂在肝毒性中的作用提供了線索。

另外5個差異蛋白均是在正常對照組中有表達(dá)，而EFV 2.5 mg·L－1處理5 h后則不表達(dá)。其中有絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的抗胰蛋白酶及其S突變體，該基因的缺失會引起肝高膽紅素血癥和一些肝酶的活性改變，并且會通過肝纖維化的途徑進(jìn)一步導(dǎo)致肝硬化［13］。還有3種差異蛋白質(zhì)，分別是細(xì)胞角蛋白，它參與蛋白質(zhì)結(jié)合及細(xì)胞骨架的組成;剪接體相關(guān)蛋白，它與mRNA的剪接相關(guān)，定位在細(xì)胞核;磷酸丙糖異構(gòu)酶，可催化磷酸二羥丙酮和右旋甘油醛3磷酸之間互換。這3種蛋白質(zhì)與肝毒性之間的相關(guān)性目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

肝是EFV最主要的代謝場所［14］。本研究在用ROS實(shí)驗(yàn)證實(shí)了EFV肝毒性的前提下，采用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法從蛋白質(zhì)表達(dá)整體水平探討EFV對肝細(xì)胞的毒性作用，有利于揭示EFV作用早期細(xì)胞的變化，為EFV肝毒性的早期診斷和機(jī)制研究提供了線索。

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Proteomic analysis and hepatotoxicity of efavirenz in hepatocytes

MA Fang1，XIONG Hua-wei2，JIA Xiao-fang1，YAO Ya-min1，LIU Xiao-qian1，ZHANG Li-jun1，3
(1.Department of Scientific Research，Shanghai Public Health Clinical Center，Shanghai201508，China;2.Department of Life Sciences，School of Life Sciences and Food Engineering，Nanchang University，Nanchang330031，China;3.Institute of Clinical Pharmacology，Central South University，Changsha410078，China)

OBJECTIVETo investigate the hepatotoxicity of efavirenz(EFV)in hepatocytes and its impact on proteome profile.METHODSThe reactive oxygen species(ROS)in cells were detected by colorimetry analysis after human liver cancer Huh7 cells were cultured with EFV 1.25，2.5，5 and 10 mg·L－1for 5 h，respectively.Cell apoptosis was analyzed by flow cytometry following Annexin-Ⅴ/propidium iodide dying after Huh7 cells were incubated with EFV 2.5 mg·L－1for 5 h.The proteins extracted from cells treated with EFV 2.5 mg·L－1or untreated control cells were separated by two-dimensional gel electrophoresis，and the differently expressed proteins in normal control and EFV 2.5 mg·L－1groups were analyzed using ImageMaster software and identified by online reversed-phase nano-flow liquid chromatography coupled with ion trap mass spectrometry.RESULTSCompared with normal control cells，the ROS content in EFV groups significantly increased(P＜0.05)，and there was a good concentration-effect relationship(r=0.9740，P＜0.05).After EFV 2.5 mg·L－1treatment for 5 h，the apoptosis percentage had no significant change，but expression level of seven proteins decreased significantly，among which mitochondrial heat shock protein 75 and antioxidant protein 1 were down-regulated 4.3 and 7.7 times by EFV，respectively.Alpha-1-antitrypsin，the S variant of alpha-1-antitrypsin，cytokeratin 9，pre-mRNA-splicing factor and triosephosphate isomerase were completely inhibited by EFV.CONCLUSIONEFV has hepatotoxicity，and EFV might regulate mitochondrial function through decreasing the expression of MTHSP75 and antioxidant protein 1 in mitochondria，which may contribute to its hepatotoxicity.

efavirenz;hepatocytes;toxicity;reactive oxygen species;proteomics

The project supported by Natural Science Foundation of Shanghai(09ZR1426300);WANG Bao-en Liver Fibrosis Foundation(20100031);and Post-doctoral Foundation of Central South University(20100471238)

ZHANG Li-jun，E-mail:zhanglijun1221@163.com，Tel:(021)37990333-5368

R978.7，R966

A

1000-3002(2011)05-0441-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2011.05.006

上海市自然科學(xué)基金(09ZR1426300);王寶恩肝纖維化基金(20100031);中南大學(xué)博士后基金(20100471238)

馬芳(1983－)，實(shí)習(xí)研究員，碩士，主要從事藥物毒理學(xué)研究;張麗軍(1969－)，副教授，博士，主要從事蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

張麗軍，E-mail:zhanglijun1221@163.com，Tel:(021)37990333-5368

2011-02-11接受日期:2011-07-07)

(本文編輯:齊春會)