郭云翮， 李 祥， 薄五海， 王艷紅 (山西省大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院外科教研室， 大同 037009)

鞘內(nèi)聯(lián)合應(yīng)用奈福泮和新斯的明對(duì)切口痛大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)

郭云翮， 李 祥， 薄五海， 王艷紅 (山西省大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院外科教研室， 大同 037009)

目的 觀察鞘內(nèi)聯(lián)合應(yīng)用鹽酸奈福泮和新斯的明的鎮(zhèn)痛作用。 方法 在大鼠切口疼痛模型上結(jié)合鞘內(nèi)置管技術(shù)，采用累積疼痛評(píng)分法評(píng)定大鼠疼痛行為;采用序貫法分別使用不同劑量奈福泮、新斯的明進(jìn)行鞘內(nèi)注射以獲得量效曲線及半效劑量(ED50)，鞘內(nèi)聯(lián)合應(yīng)用不同比例的ED50劑量獲得聯(lián)合用藥時(shí)藥物各自的半效劑量以分析兩藥的相互作用。 結(jié)果 ①據(jù)公式得出鞘內(nèi)注射 50 －150 μg的奈福泮的 ED50值為 82.64 μg，95%可信區(qū)間為 80.4 －97.4 μg;鞘內(nèi)注射劑量 1 －10 μg的新斯的明的 ED50值為 8.36 μg，95%可信區(qū)間為 6.68 －10.70 μg;鞘內(nèi)合用 1/2，1/4，1/8，1/16 ED50的奈福泮和新斯的明各自的 ED50值分別為:奈福泮 10.93 μg，95%可信區(qū)間 6.83 －17.49 μg;新斯的明 1.05 μg，95%可信區(qū)間為 0.66 －1.68 μg。②奈福泮和新斯的明單獨(dú)應(yīng)用及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)切口疼痛大鼠均產(chǎn)生劑量依賴(lài)型的鎮(zhèn)痛作用。③據(jù)Tallarida等提出的Isobologram作圖方法分析得出新斯的明和奈福泮的相互作用是協(xié)同的。 結(jié)論 ①奈福泮50－150 μg、新斯的明5－15 μg鞘內(nèi)應(yīng)用均可產(chǎn)生劑量依賴(lài)性的鎮(zhèn)痛作用。②奈福泮和新斯的明的鎮(zhèn)痛作用存在協(xié)同作用。

奈福泮; 新斯的明; 序貫法; 鞘內(nèi)注射; 切口疼痛; 大鼠

奈福泮(nefopam)是一種新型非麻醉性鎮(zhèn)痛藥，其作用與阿片受體無(wú)關(guān);新斯的明(neostigmine)是一種膽堿酯酶抑制劑，近幾年實(shí)驗(yàn)和臨床研究［1］均顯示鞘內(nèi)注射(intrathal injection)具有明顯的抗傷害作用和鎮(zhèn)痛作用。在脊髓水平，新斯的明的鎮(zhèn)痛作用與阿片類(lèi)藥、局麻藥、可樂(lè)定均有協(xié)同效應(yīng)［2］，而與奈福泮聯(lián)用無(wú)相關(guān)報(bào)道。奈福泮與新斯的明在脊髓水平的鎮(zhèn)痛作用及相互作用怎樣，是否具有協(xié)同效應(yīng)，是否可以作為聯(lián)合鎮(zhèn)痛藥物作用于臨床治療術(shù)后疼痛是非常有意義的值得研究的問(wèn)題。本研究的目的就是觀察鞘內(nèi)聯(lián)合應(yīng)用奈福泮和新斯的明對(duì)切口術(shù)后大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)及其相互作用。

1 材料和方法

1.1 藥品和試劑 奈福泮注射液(nefopam hydrochloride injection，湖北同濟(jì)奔達(dá)鄂北制藥有限公司);新斯的明(neostigmine，上海信誼金朱藥業(yè)有限公司);異氟醚(isoflurane，上海朗源化工有限公司);麻醉機(jī)(德國(guó)Drager麻醉機(jī)，德?tīng)柛襻t(yī)療設(shè)備有限公司)

1.2 鞘內(nèi)置管的模型制備 體重250－300 g的雄性SD大鼠，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，以5%的水合氯醛0.6 ml/kg腹腔注射麻醉后，按楊建平法［3］在大鼠蛛網(wǎng)膜下隙植入PE10聚乙烯導(dǎo)管(實(shí)驗(yàn)藥物均經(jīng)所埋導(dǎo)管注入蛛網(wǎng)膜下隙)，妥善固定，術(shù)畢給予20 g/L利多卡因注射液20 μl，凡是10 s內(nèi)兩后肢不能負(fù)重、拖地以及針刺小腿無(wú)回縮等逃避反應(yīng)，16－20 min以后又恢復(fù)負(fù)重者為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，飼養(yǎng)5 d后用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 切口疼痛模型的建立 大鼠吸入濃度為1.4%的異氟醚麻醉后，將其左后爪進(jìn)行消毒，按Brennan等［4］法從足底近端0.5 cm處向趾部作一長(zhǎng)約1 cm的切口。切開(kāi)皮膚，用眼科鑷挑起足底肌肉并縱向切割，保持肌肉的起止及附著完整，按壓止血，用細(xì)線縫合皮膚共兩針即成切口疼痛模型。

1.4 動(dòng)物分組 采用Tallarida等［5］提出的Isobologram簡(jiǎn)易作圖的分析方法，先分別求出奈福泮與新斯的明單獨(dú)使用時(shí)的ED50，再將此兩藥的1/2，1/4，1/8，1/16 ED50合用，便可求出二者合用時(shí)的各自的ED50，用二藥合用時(shí)的ED50與二藥單獨(dú)使用時(shí)的各自的ED50，作Isobologram圖，看是否存在協(xié)同作用。

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)及確定的有效指標(biāo)，鞘內(nèi)給予新斯的明對(duì)切口疼痛大鼠鎮(zhèn)痛作用的ED50值可能在5－15 μg范圍，以此范圍為準(zhǔn)，采用等比系數(shù)(r)為1.316，設(shè)立 5 個(gè)劑量即 5，6.6，8.7，11.4，15 μg，取20只大鼠用于序貫實(shí)驗(yàn)為新斯的明組;鞘內(nèi)給予奈福泮對(duì)切口疼痛大鼠鎮(zhèn)痛作用的ED50值可能在50 －150 μg 之間，采用等比系數(shù)(r)為1.316，設(shè)立5個(gè)劑量即 50，65.8，86.6，113.9，150 μg，取 20 只大鼠用于序貫實(shí)驗(yàn)為奈福泮組。分別求出奈福泮和新斯的明的 ED50后，將二藥的 ED50的1/2，1/4，1/8，1/16合用，仍取20只大鼠采用序貫法求出二藥合用時(shí)各自的ED50為合用組。另有一組是生理鹽水對(duì)照組，5只大鼠。所有大鼠均按隨機(jī)分配原則入組，而給藥時(shí)采用單盲法。

1.5 序貫法 序貫法［5］是將小鼠一只一只序貫地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。先進(jìn)行對(duì)照組實(shí)驗(yàn)，再行奈福泮、新斯的明組、合用組實(shí)驗(yàn)。以實(shí)驗(yàn)組大鼠累積疼痛評(píng)分比對(duì)照組大鼠累積疼痛評(píng)分減少50%為鎮(zhèn)痛有效指標(biāo)。奈福泮、新斯的明組大鼠均首先從最大劑量開(kāi)始，若有效則下一只用低一級(jí)的劑量，若無(wú)效則下一只用高一級(jí)的劑量，如此序貫進(jìn)行，直至試驗(yàn)至預(yù)先已決定好的動(dòng)物數(shù)為止，據(jù)公式計(jì)算出ED50值及其95%可信區(qū)間(CI)。

1.6 行為學(xué)實(shí)驗(yàn) 采用累積疼痛評(píng)分法［4］評(píng)定疼痛強(qiáng)度，待大鼠手術(shù)清醒后觀察兩后爪著地及負(fù)重情況，后爪被壓迫發(fā)白表示負(fù)重，如后爪翹起不著地，記2分;如后爪著地但不負(fù)重，記1分;如后爪著地并且負(fù)重，記0分。從術(shù)后1 h起每5 min觀察1次，每次1 min，以1 min內(nèi)最常采取的姿勢(shì)為標(biāo)準(zhǔn)，共觀察1 h，以術(shù)側(cè)足評(píng)分減去對(duì)側(cè)足評(píng)分即為所得累積疼痛評(píng)分(1－24分)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所得數(shù)據(jù)采用±s表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。累積疼痛評(píng)分的比較作單因素方差分析;組間比較先作方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊則采用最小顯著法(LSD法)，若方差不齊，則用秩和檢驗(yàn)比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;理論上相加效應(yīng)時(shí)的ED50值與實(shí)測(cè)的ED50值采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，若實(shí)測(cè)值低于理論值，且X軸和Y軸上差異的P值均小于0.05，則認(rèn)為兩種藥物之間具有協(xié)同效應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 奈福泮、新斯的明單獨(dú)與聯(lián)合應(yīng)用的ED50值及95%的可信區(qū)間 對(duì)照組累積疼痛評(píng)分值17±2.9，以累積疼痛評(píng)分8.5為鎮(zhèn)痛有效指標(biāo)做出序貫實(shí)驗(yàn)，各組序貫實(shí)驗(yàn)，ED50及95%可信區(qū)間結(jié)果見(jiàn)表1－6。根據(jù)計(jì)算公式得出奈福泮 ED50為88.5 μg，95% 可信區(qū)間為 80.4 － 97.4 μg;新斯的明的ED50為 8.36 μg，95%可信區(qū)間為 6.68 －10.70 μg;兩藥合用時(shí)新斯的明的 ED50為 1.05 μg，95% 可信區(qū)間為 0.66 －1.68 μg;奈福泮的 ED50為 10.93 μg，95%可信區(qū)間為6.83 －17.49 μg。

表1 鞘內(nèi)單獨(dú)應(yīng)用奈福泮序貫實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Sequential experiment results of intrathecal nefopam

表2 鞘內(nèi)單獨(dú)應(yīng)用奈福泮的ED50及95%可信區(qū)間Tab 2 ED50and 95%confidence intervals of intrathecal nefopam

表3 鞘內(nèi)單獨(dú)應(yīng)用新斯的明序貫實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Sequential experiment results of intrathecal neostigmine

表4 鞘內(nèi)單獨(dú)應(yīng)用新斯的明的ED50及95%可信區(qū)間Tab 4 ED50and 95%confidence intervals of intrathecal neostigmine

表5 鞘內(nèi)奈福泮與新斯的明聯(lián)合用藥序貫實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 5 Sequential experiment results of intrathecal administration of both nefopam and neostigmine

表6 鞘內(nèi)奈福泮與新斯的明聯(lián)合用藥時(shí)奈福泮和新斯的明各自的ED50及95%可信區(qū)間Tab 6 ED50and 95%confidence intervals of intrathecal nefopam and neostigmine after combined administration

2.2 序貫法測(cè)定的累積疼痛評(píng)分 對(duì)照組大鼠的術(shù)側(cè)足常翹起，偶爾著地，但極少負(fù)重;奈福泮組、新斯的明組及合用組術(shù)側(cè)足均可著地，并且負(fù)重。對(duì)照組累積疼痛評(píng)分19±4，其他組累積疼痛評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表7。與對(duì)照組相比，術(shù)后鞘內(nèi)注射奈福泮組、新斯的明組及合用組均可明顯降低累積疼痛評(píng)分(P＜0.05)，各用藥組無(wú)明顯差異。由表7所示可認(rèn)為奈福泮和新斯的明單獨(dú)應(yīng)用及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)切口疼痛大鼠均產(chǎn)生劑量依賴(lài)型的鎮(zhèn)痛作用。

表7 各組中不同劑量的累積疼痛評(píng)分值Tab 7 Cumulative pain scores of rats after different doses of drugs in 3 groups

2.3 Isobologram分析 根據(jù)Isobologram方法和已經(jīng)求得的實(shí)驗(yàn)值，可作出Isobologram圖。由圖1可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)點(diǎn)(10.93，1.05)明顯在理論累加等位線的下方，且其95%可信區(qū)間不與理論累加點(diǎn)重合，理論上相加效應(yīng)時(shí)的ED50值與實(shí)測(cè)的ED50值比較后，X軸上P＜0.05;Y軸上P＜0.05，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此可以認(rèn)為鹽酸奈福泮和新斯的明的相互作用是協(xié)同的。

圖1 Isobologram方法檢測(cè)奈福泮和新斯的明的相互作用Fig 1 Isobologram for analyzing the interaction of nefopam and neostigmine

3 討論

序貫法是一種探討用藥劑量或濃度的經(jīng)典方法［6］。本研究采用此方法探討鞘內(nèi)注射奈福泮、新斯的明對(duì)切口疼痛大鼠產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用的有效劑量。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，鞘內(nèi)給予奈福泮、新斯的明及合用組劑量后動(dòng)物陽(yáng)性和陰性變化比較集中，故結(jié)果重復(fù)性較好，可靠。

本實(shí)驗(yàn)采用的外周傷害性刺激模型系大鼠切口疼痛模型，此模型是由Brennan等［3］提出的，一直延續(xù)至今。施行切口手術(shù)的大鼠表現(xiàn)自發(fā)性疼痛行為，與臨床上外科手術(shù)和術(shù)后狀態(tài)一致。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)奈福泮和新斯的明鞘內(nèi)單獨(dú)應(yīng)用及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)切口疼痛大鼠均產(chǎn)生劑量依賴(lài)型的鎮(zhèn)痛作用。另外一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)是，在大鼠切口疼痛模型中鞘內(nèi)聯(lián)合應(yīng)用新斯的明和奈福泮的鎮(zhèn)痛作用具有協(xié)同效應(yīng)。加強(qiáng)藥物相互作用的可能性主要包括以下兩種情況:①降低藥物的清除率。盡管在本研究中對(duì)藥物的重分布情況并未進(jìn)行研究，但聯(lián)合用藥組藥物的作用時(shí)間并未發(fā)生明顯的變化，所以不認(rèn)為藥物的清除率發(fā)生改變。②受體的功能性相互作用。如存在受體之間的功能性相互作用，那么新斯的明與奈福泮聯(lián)合應(yīng)用是通過(guò)兩種不同的效應(yīng)系統(tǒng)發(fā)揮作用的。新斯的明通過(guò)毒蕈堿受體作用于神經(jīng)元細(xì)胞膜上與G蛋白耦聯(lián)的受體，受體激活后可以增加神經(jīng)元細(xì)胞膜對(duì)鉀離子的通透性，通過(guò)神經(jīng)元的超極化而抑制神經(jīng)元活動(dòng)［7］;而奈福泮的鎮(zhèn)痛機(jī)制之一是可阻斷突觸前電壓敏感鈉通道減少Ca2+內(nèi)流，使谷氨酸釋放減少，導(dǎo)致NMDA受體神經(jīng)元興奮性的降低［8］。可能脊髓背角膽堿能受體與NMDA受體之間產(chǎn)生相互作用。因此，在本實(shí)驗(yàn)中，受體之間功能性相互作用可能增加，新斯的明和奈福泮聯(lián)合用藥產(chǎn)生的協(xié)同作用可能有賴(lài)于膽堿能受體NMDA受體的激活。盡管存在著上述假設(shè)，但其確切機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

聯(lián)合鎮(zhèn)痛的目的就是以最小劑量來(lái)獲得最理想的鎮(zhèn)痛效果，而副作用最小。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中鞘內(nèi)聯(lián)合應(yīng)用奈福泮或/和新斯的明于術(shù)后疼痛大鼠觀察到明顯的鎮(zhèn)痛效果，未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)，可以達(dá)到聯(lián)合鎮(zhèn)痛的目的。但在臨床應(yīng)用中能否達(dá)到預(yù)期的效果有待于做臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

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Effects of intrathecal nefopam and neostigmine on incision pain in rats

GUO Yun-he，LI Xiang，BO Wu-hai，WANG Yan-hong(Dept of Surgery，Medical College of Shanxi Datong University，Datong 037009，China)

ObjectiveTo explore the effect of intrathecal nefopam and neostigmine on postoperative pain in rats.MethodsAfter intrathecal implantation，the incision pain rat models were established and used to evaluate the pain behaviors by cumulative pain scores.The dose-response curve and the 50%effective dose(ED50)were obtained after intrathecal injection of neostigmine and nefopam using sequential methods.The ED50of neostigmine and nefopam were calculated for observing the drug interactions when different fractions of ED50of both neostigmine and nefopam were administered together.Results①The ED50of intrathecal nefopam(50 －150 μg)alone was 82.64 μg and 95%confidence intervals(CI)were 72.53 － 94.14 μg.The ED50of intrathecal neostigmine(1 － 10 μg)alone was 8.36 μg and 95%confidence intervals were 6.68 － 10.70 μg.When the two drugs were used together at the doses of 1/2ED50，1/4ED50，1/8ED50and 1/16ED50，the ED50of nefopam was 10.93 μg(95%CI 6.83 －17.49 μg)，and the ED50of neostigmine was 1.05 μg(95%CI 0.66 －1.68 μg).②Intrathecal administration of nefopam，neostigmine or their combination produced a significant dose-dependent analgesic effect in incision pain rats.③According to the Isobologram methods by Tallarida，it was deduced that nefopam and neostigmine had the synergistic analgesic interaction.Conclusion①Nefopam at the dose of 50－150 μg and neostigmine at the dose of 1 －10 μg，both can produce a dose-dependant analgesic effect.②The analgesic effect of neotigmine and nefopam was synergistic.

nefopam;neotigmine;sequential method;intrathal injection;incision pain;rats

R969.2

A

1007 －6611(2011)02 －0112 －05

10.3969/J.ISSN.1007 －6611.2011.02.004

郭云翮，女，1977－03生，碩士，助教，E-mail:syh2959@sina.com.

2010－09－06］