崔龍, 李志, 孫亞楠, 張南

(1.北華大學(xué)藥學(xué)院,吉林132013;2.中國(guó)石油吉林石化公司,吉林132021)

車前子環(huán)烯醚萜苷類化合物與其抑制PTP1B的活性研究

崔龍1, 李志2, 孫亞楠1, 張南1

(1.北華大學(xué)藥學(xué)院,吉林132013;2.中國(guó)石油吉林石化公司,吉林132021)

蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B在胰島素信號(hào)傳達(dá)過(guò)程中起負(fù)調(diào)控作用,也是研究治療2型糖尿病的重要靶點(diǎn).利用生物活性導(dǎo)向分離方法從車前子中分離得到6個(gè)環(huán)烯醚萜苷類活性化合物.通過(guò)光譜和文獻(xiàn)比較鑒定,6種化合為Desacetylhookerioside(1),Hookerioside(2),A lpinoside(3),Majo roside(4),Anagalloside(5)和10-hydroxymajoroside(6),其中化合物3和5可以有效抑制 PTP1B的活性,其 IC50值分別為(17.7±2.5)和(19.8±1.2)μM.

車前子;環(huán)烯醚萜苷;蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B

0 引言

2型糖尿病是一種常見的代謝紊亂疾病,其特征是外周對(duì)胰島素產(chǎn)生抵抗作用,在分子水平表現(xiàn)為胰島素與胰島素受體結(jié)合后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)缺失.蛋白酪氨酸的磷酸化水平是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要調(diào)節(jié)因素,它由蛋白酪氨酸激酶(PTK)和蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)共同調(diào)控[1].近年研究發(fā)現(xiàn),蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)可以去磷酸化蛋白酪氨酸,在胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著重要的負(fù)調(diào)控作用[2].敲除PTP1B基因[3-4],或運(yùn)用反義核苷酸(ASO)抑制體內(nèi) PTP1B蛋白和m RNA的表達(dá)[5],不僅可以顯著提高受試小鼠對(duì)胰島素的敏感性,而且能明顯降低肥胖癥的患病

幾率.這些研究表明,PTP1B有可能成為治療2型糖尿病的新靶點(diǎn).因此,對(duì)小分子 PTP21B抑制劑的研究已成為近年來(lái)胰島素增敏劑研究的熱點(diǎn)之一[6].

車前子為車前科植物車前Plantagoasiatica L的干燥成熟種子[7],具有清熱利尿、明目祛痰的功效.現(xiàn)代研究證明,車前子還具有致泄、護(hù)肝、降壓、血清膽固醇等多種藥理作用,主要用于治療各種便秘、肥胖癥等[8].目前,從這種植物中已經(jīng)分離出類黃酮和環(huán)烯醚萜苷類等化合物,并且證實(shí)了這些化合物的抗氧化和抗微生物等活性[9-10].關(guān)于車前子的成分研究雖然比較多,但是其成分與抑制 PTP1B活性方面的研究仍處于空白狀態(tài),本論文首次報(bào)道了從車前子中篩選 PTP1B抑制劑,并進(jìn)行了構(gòu)效方面的比較研究.

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 儀器、試劑及材料

1H,13C-NMR用 INOVA-500 MHz型核磁共振儀(美國(guó) CIL公司,TMS為內(nèi)標(biāo));MS用QSTAR質(zhì)譜儀;EL ISA酶標(biāo)儀(美國(guó));反相薄層色譜板(Rp-18 F254)為Merck公司產(chǎn)品;反相柱色譜用硅膠ODS為Nacalai Tesque公司產(chǎn)品;大孔CHP-20為 Pharmacia公司產(chǎn)品;所用試劑均為分析純(國(guó)藥集團(tuán)).

車前子于2008年10月采于吉林省白山市長(zhǎng)白山周邊地區(qū),經(jīng)過(guò)專家鑒定為PlantagoasiaticaL.標(biāo)本收藏于北華大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室(標(biāo)號(hào)為:CQZ 20081003).

1.2 提取和分離

取車前子500 g,用5 L甲醇溶液室溫浸泡,連續(xù)浸泡3次,每次24 h.合并提取液,然后減壓濃縮甲醇提取液,回收甲醇.將濃縮提取物用適量水混懸,依次用正己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取.可溶于正丁醇的部分(IC50=30.2μg/mL,105.0 g)用反相(RP-18)色譜柱(10×30 cm,40～63μm)分離,以水-甲醇(體積比為100∶1至1∶1)梯度洗脫,洗脫餾分根據(jù)薄層板點(diǎn)板情況合并相同部分,共分為5個(gè)組分.組分5經(jīng)硅膠色譜柱(10×30 cm,75～150μm)分離,以水-甲醇(體積比為70∶1至50∶1)梯度洗脫,所得餾分再經(jīng)過(guò)CHP-20柱色譜純化,流動(dòng)相為水-甲醇(體積比為50∶1至 1∶1),分別得到純的化合物 1(16.0 mg,0.03%),化合物 2(11.0 mg,0.03%),化合物3(15.0mg,0.05%),化 合 物 4(7.0 mg,0.09%),化合物 5(9.0 mg,0.1%),化合物6(7.0mg,0.1%).

圖1 化合物1-6的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1.3 抑制PTP1B活性的試驗(yàn)

PTP1B酶購(gòu)至于 B IOMOL公司.放入 2 mmol對(duì)硝基苯基磷酸、PTP1B酶和含有 50 mmol檸檬酸、0.4mmol NaCl、2mmol EDTA 和2mmol DTT的緩沖液,在30℃下保溫45 min,最后用1 mmol NaOH終結(jié)反應(yīng),通過(guò)測(cè)量其在410 nm的吸收值變化,計(jì)算出其抑制率.

2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1為白色粉末.ESI-MSm/z:535[M-H]-;1H-NMR(400 MHz,D2O):δ7.60(s,H-3),6.30(s,H-1),5.59(d,J=8.0 Hz,H-1″),4.85(d,J=8.0 Hz,H-1′),4.32(d,J=12.0 Hz,H-10a),4.20(d,J=12.0 Hz,H-10b),2.49(m,3H,CH2-7 and H-6a),1.48(m,H-6b);13C-NMR (100 MHz,D2O):δ168.2(C-11),154.2(C-3),143.8(C-8),130.0(C-9),113.2(C-4),99.3(C-1′),94.6(C-1″),92.6(C-1),77.5(C-5″),77.0(C-5′),76.5(C-3′),76.3(C-3″),73.5(C-2′),72.9(C-2″),70.2(C-4′),70.1(C-4″),61.7(C-6″),61.4(C-10),61.2(C-6′),37.8(C-5),35.8(C-7),31.5(C-6).Compound 1通過(guò)文獻(xiàn)比較確定為Desacetylhookerioside[11].

化合物2為白色粉末.ESI-MSm/z:577[M-H]-;1H-NMR(400 MHz,D2O):δ7.48(s,H-3),6.24(s,H-1),5.47(d,J=8.0 Hz,H-1″),4.82(d,J=8.0 Hz,H-1′),4.42(d,J=12.0 Hz,H-10a),4.23(d,J=12.0 Hz,H-10b),2.46(m,3H,CH2-7 and H-6a),2.06(s,CH3CO-),1.46(m,H-6b);13C-NMR(100 MHz,D2O):δ173.6(CH3CO-),167.3(C-11),153.5(C-3),143.6(C-8),130.3(C-9),113.4(C-4),99.5(C-1′),94.3(C-1″),92.4(C-1),76.9(C-5″),76.5(C-5′),74.5(C-3′),73.3(C-3″),73.1(C-2′),72.8(C-2″),70.6(C-4′),70.5(C-4″),61.5(C-6″),61.3(C-10),61.1(C-6′),36.8(C-5),34.8(C-7),31.4(C-6),20.2(CH3CO-).Compound 2通過(guò)文獻(xiàn)比較確定為Hookerioside[12].

化合物3為白色粉末.ESI-MSm/z:415[M-H]-;1H-NMR(400 MHz,D2O):δ7.06(s,H-3),6.22(s,H-1),4.80(d,J=8.0 Hz,H-1′),4.75(m,10-CH2),2.48(m,3H,CH2-7 and H-6a),2.06(s,CH3CO-),1.47(m,H-6b);13C-NMR (100 MHz,D2O):δ174.6(CH3CO-),168.5(C-11),146.6(C-3),137.4(C-8),133.4(C-9),119.2(C-4),99.8(C-1′),91.8(C-1),77.2(C-5′),76.3(C-3′),73.4(C-2′),70.3(C-4′),61.6(C-10),61.4(C-6′),39.3(C-5),34.2(C-7),31.2(C-6),21.3(CH3CO-).化合物3通過(guò)文獻(xiàn)比較確定為A lpinoside[11].

化合物4為白色粉末.ESI-MSm/z:402[M-H]-;1H-NMR(400 MHz,D2O):δ7.03(s,H-3),6.20(s,H-1),4.82(d,J=8.0 Hz,H-1′),2.48(m,H-6a),3.42(s,CH3O-),1.47(m,H-6b),1.33(—CH3);13C-NMR(100 MHz,D2O):δ168.3(C-11),146.4(C-3),137.2(C-8),133.5(C-9),119.6(C-4),99.7(C-1′),91.9(C-1),77.3(C-5′),76.4(C-3′),74.1(C-7),73.3(C-2′),70.1(C-4′),61.2(C-6′),52.9(CH3O-),39.2(C-5),31.4(C-6),11.1(CH3-).化合物4通過(guò)文獻(xiàn)比較確定為Majoroside[12].

化合物5為白色粉末.ESI-MSm/z:372[M-H]-;1H-NMR(400 MHz,D2O):δ7.06(s,H-3),6.23(s,H-1),4.86(d,J=8.0 Hz,H-1′),2.45(m,3H,CH2-7 and H-6a),1.46(m,H-6b),1.34(—CH3);13C-NMR(100 MHz,D2O):δ168.3(C-11),146.4(C-3),137.2(C-8),133.5(C-9),119.6(C-4),99.7(C-1′),91.9(C-1),77.3(C-5′),76.4(C-3′),73.3(C-2′),70.1(C-4′),61.2(C-6′),39.2(C-5),34.8 (C-7),31.4 (C-6),11.7(CH3—).化合物5通過(guò)文獻(xiàn)比較確定為Anagalloside[13].

化合物 6為白色粉末.ESI-MSm/z:418[M-H]-;1H-NMR(400 MHz,D2O):δ7.05(s,H-3),6.23(s,H-1),4.80(d,J=8.0 Hz,H-1′),2.45(m,H-6a),3.40(s,CH3O-),1.48(m,H-6b),1.37(—CH3);13C-NMR(100 MHz,D2O):δ168.5(C-11),146.1(C-3),137.3(C-8),133.2(C-9),119.4(C-4),99.5(C-1′),91.7(C-1),77.4(C-5′),76.6(C-3′),74.12(C-7),73.4(C-2),70.0(C-4′),66.8(C-10),61.4(C-6′),52.6(CH3O —),39.6(C-5),31.6(C-6).化合物6通過(guò)文獻(xiàn)比較確定為10-hydroxymajo roside[12].

3 結(jié)果與討論

通過(guò)體外PTP1B活性檢測(cè)平臺(tái),測(cè)定6個(gè)化合物對(duì)PTP1B的活性抑制作用,結(jié)果見表1.在活性測(cè)試中,用RK-682作為對(duì)照品.通過(guò)對(duì)已篩選出的化合物結(jié)構(gòu)和活性比較,發(fā)現(xiàn)化合物3和5表現(xiàn)出顯著的抑制 PTP1B活性,其 IC50值范圍在(17.7±2.5)到(19.8±1.2)μm;而化合物 1、2、4和6與化合物3和5比較,顯示出非常弱的抑制PTP1B活性作用.這表明化合物結(jié)構(gòu)中C-11位被葡萄糖基或甲基取代能顯著降低化合物抑制PTP1B活性,還說(shuō)明表現(xiàn)出化合物4和6結(jié)構(gòu)中C-7位置上的羥基對(duì)該類化合物抑制 PTP1B活性無(wú)作用;反之,C-11位置連有羧基則顯著增加抑制PTP1B活性.此外,化合物3和5活性較高,這表明在結(jié)構(gòu)中C-10位被乙?；〈鷮?duì)其抑制PTP1B活性影響不大.

表1 化合物1-6有效抑制PTP1B活性的濃度

4 結(jié)論

本文以 PTP1B生物活性為向?qū)?從車前子中篩選出對(duì)PTP1B有顯著抑制作用的環(huán)烯醚萜苷類化合物.雖然本文對(duì)帶有羧基的環(huán)烯醚萜苷類化合物的構(gòu)效關(guān)系沒有進(jìn)行更深入的研究,但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,被羧基取代的環(huán)烯醚萜苷類化合物,在體外對(duì)PTP1B的活性抑制起很重要作用.因此,進(jìn)一步優(yōu)化環(huán)烯醚萜苷類衍生物,研究其在細(xì)胞體內(nèi)外中的降糖作用機(jī)理,或許能夠找到潛在的用于治療2型糖尿病和肥胖癥的新的PTP1B抑制劑.

本課題部分資金來(lái)源于長(zhǎng)白山生物資源與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(延邊大學(xué)),在此表示衷心的感謝.

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Protein Tyrosine Phosphatase 1B Inhibitory Activity of Iridoid Glucosides Isolated from Plantago Asiatica

CU ILong1, L IZhi2, SUN Ya-nan1, ZHANG Nan1
(1.CollegeofPharmacy,BeihuaUniversity,Jilin132013,China;2.ChinaPetroleumJilinPetrochemicalCo.,Ltd.,Jilin132021,China)

Protein tyrosine phosphatase 1B p lays amajor role in the negative regulation of insulin signaling,and thus considered as an attractive therapeutic target fo r diabetes.Bioassay-guided fractionation of the seeds ofPlantagoasiaticaafforded six p rotein tyrosine phosphatase 1B inhibito ry iridoid glucosides(1-5).Six compounds were identified as Desacetylhookerioside(1),Hookerioside(2),Alpinoside(3),Majo roside(4)Alpinoside(5)and 10-hydroxymajo roside(6)by comparison of their spectral data with those in the literature.Isolated compounds 3 and 5 inhibited PTP1B with IC50values ranged from(17.7±2.5)to(19.8±1.2)μM.

Plantagoasiatica;iridoid glucosides;PTP1B

R284

A

1004-4353(2011)02-0180-04

2011-05-04

教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金

崔龍(1971—),男,博士,副教授,研究方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué).