賀玖明, 劉影, 劉明韜, 張瑞萍, 石建功, 再帕爾·阿不力孜

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100050)

小蠟樹提取物多組分的同步結(jié)構(gòu)分析方法研究

賀玖明, 劉影, 劉明韜, 張瑞萍, 石建功, 再帕爾·阿不力孜＊

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100050)

以小蠟樹乙醇提取物為研究對象,基于不完全分離分析的策略,采用Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離手段,獲取了含量呈連續(xù)動態(tài)變化的系列混合物;運(yùn)用NMR/LC-MS平行動態(tài)譜方法,對系列混合物中含有氫醌苷及苯乙醇苷類化合物的成分進(jìn)行了快速結(jié)構(gòu)分析.在小蠟樹提取物M-9中,實(shí)現(xiàn)了12個(gè)成分無需完全分離的同步結(jié)構(gòu)鑒定,其中4個(gè)成分為首次在本屬植物中發(fā)現(xiàn).本研究進(jìn)一步拓寬了NMR/LC-MS PDS新型分析方法的應(yīng)用范圍.

NMR/LC-MS平行動態(tài)譜;不完全分離分析;小蠟樹;苯乙醇苷;氫醌苷

0 引言

從中草藥中發(fā)現(xiàn)新穎結(jié)構(gòu)的活性成分,將其進(jìn)一步開發(fā)成新藥是推動中藥現(xiàn)代化進(jìn)程的重要內(nèi)容.中草藥發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)是結(jié)構(gòu)復(fù)雜、化學(xué)多樣性的天然產(chǎn)物組分群,但傳統(tǒng)的分析方法對其有效成分或活性分子群的發(fā)現(xiàn)率較低,而且需要的樣品量大,提取分離及其鑒定耗時(shí)費(fèi)力,還易導(dǎo)致微量活性或不穩(wěn)定未知成分的丟失[1-3].近年來,隨著各種聯(lián)用技術(shù)的迅速發(fā)展,其在復(fù)雜混合物體系分析中的作用也越來越重要.高效液相色譜(HPLC)與質(zhì)譜(MS)和核磁共振

譜(NMR)的聯(lián)用技術(shù),如 LC-MS/MS、LC-NMR及LC-MS-NMR等融合了高效分離和豐富結(jié)構(gòu)信息獲取的強(qiáng)大功能,實(shí)現(xiàn)了混合物復(fù)雜成分的高效、快速的分析鑒定[4-17],并且此類聯(lián)用技術(shù)還具有“先分離、后分析”的特點(diǎn).

針對復(fù)雜體系混合物的快速、準(zhǔn)確分析,本課題組[18]提出了無需完全分離分析的研究策略,建立并發(fā)展了兩種新型的譜學(xué)分析方法,即NMR/LC-MS平行動態(tài)譜(NMR/LC-MS parallel dynamic spectroscopy,NMR/LC-MS PDS)和異相關(guān)譜(NMR/LC-MS hetero-correlation spectroscopy,NMR/LC-MS HCS).該方法在不完全分離研究策略的基礎(chǔ)上,結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對系列混合物樣品的LC-MS及NMR譜數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析,從而發(fā)掘來自于同一成分的LC-MS及NMR譜數(shù)據(jù)的內(nèi)在相關(guān)性,簡化了復(fù)雜藥用植物提取物的分離分析過程;在離線的情況下,通過“數(shù)學(xué)聯(lián)用的方式”獲得了與LC-MS-NMR聯(lián)用技術(shù)相似的分析結(jié)果,最終實(shí)現(xiàn)了多組分無需完全分離且快速的分析鑒定,為復(fù)雜混合物中多組分的高效、快速結(jié)構(gòu)分析提供了新的方法.目前,該方法已成功地應(yīng)用于新疆維吾爾民族藥用植物草棉活性提取物、常用中藥連翹提取物和珍惜瀕危藥用植物福建金線蓮中黃酮醇苷類、苯乙醇苷類和有機(jī)酸類等成分的分析中[18-21].

本研究在前期研究的基礎(chǔ)上,以編號為M-9的小蠟樹乙醇提取物為研究對象,采用Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離手段,基于不完全分離分析的策略獲取含量呈連續(xù)動態(tài)變化的系列混合物,然后運(yùn)用NMR/LC-MS PDS方法,對系列混合物中含有氫醌苷及苯乙醇苷類化合物的成分進(jìn)行了分析鑒定.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

儀器有:Agilent 1100系列高效液相色譜儀(A gilent Technologies,Waldbronn,Germany);美國AB公司QTRAPTM型四極桿-線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀,配有電噴霧離子源(ESI)及Analyst 1.4.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);美國 Varian公司 INOVA-600型核磁共振儀.試劑有:甲醇(色譜純,Merk,德國);甲醇(色譜純,天津永大化學(xué)試劑開發(fā)中心);水(娃哈哈純凈水);氘代二甲基亞砜,含0.03%(體積比)的四甲基硅烷(Cam bridge Isotope Labo rato ries,Inc.).

1.2 樣品及其濃度呈連續(xù)動態(tài)變化的系列混合物的制備

編號為M-9的小蠟樹提取物由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所石建功研究員的課題組提供.制備步驟為:小蠟樹莖枝乙醇提取物經(jīng)大孔樹脂分離獲得水洗脫部分,再經(jīng)硅膠柱層析梯度洗脫得到流份;稱取0.7 g提取物M-9,加入10%甲醇適量將其溶解,上樣至Sephadex LH-20凝膠柱;以甲醇/水(體積比為10∶90)為洗脫液進(jìn)行洗脫,從有顏色的流份開始收集,以每10 m L為一管收集并編號,共獲得40個(gè)流份,備用.

1.3 測試條件

色譜條件:Extend-C18(4.6×250 mm,5μm,Agilent,USA)色譜柱;以水和乙腈為流動相進(jìn)行梯度洗脫,在0～20min內(nèi),乙腈的比例從7%增加到10%;流速為0.7 m L/min;柱后3∶1分流(1/4進(jìn)入質(zhì)譜儀);紫外吸收檢測波長為190～400 nm.

質(zhì)譜條件:負(fù)離子檢測方式(噴霧電壓為-4.5 kV);DP電壓(-70 V);EP電壓(-10 V);源溫度為375℃;GS1(霧化氣)為65 arb;GS2(干燥氣)為50 arb;碰撞能量(CE)為-15～-30 eV;掃描均選用線性離子阱(L IT)模式,速度為1 000Da/s;各種氣路均為氮?dú)?

1H-NMR譜測定條件:操作溫度為298 K;采用z梯度三共振探頭;操作軟件為Varian Vnm r 6.0 C soft ware;1H-NMR譜測定的譜寬為-1～14 ppm(9 615 Hz);弛豫時(shí)間為20 s;采樣時(shí)間為8.82 m in;采樣次數(shù)為24次;采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)為64 K(65 536個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn));1D TOCSY譜混合時(shí)間為120 ms;1H-1H COSY譜弛豫時(shí)間為1.3 s;NOESY實(shí)驗(yàn)的預(yù)飽和時(shí)間為1.6 s,混合時(shí)間為800ms.

1.4 LC-MSn及1 H-NMR譜的測定

LC-UV-MS及LC-MSn譜的測定:取上述經(jīng)凝膠色譜分離獲得的系列混合物流份,從每個(gè)流份中取出0.5 m L的溶液,經(jīng)微孔濾膜過濾后進(jìn)行LC-MSn譜分析,進(jìn)樣量為10μL.

1H-NMR譜的測定:LC-UV-MS譜的分析結(jié)果表明,提取物M-9中的組分主要分布在15～35號系列流份中.依據(jù)該分析結(jié)果,選取其中的18個(gè)流份,分別經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑后,用適量甲醇溶液轉(zhuǎn)移到5 mm的NMR譜用測試管中,用氮?dú)獯蹈?然后加入0.5 m L氘代二甲基亞砜(DMSO-d6)溶解,進(jìn)行1H-NMR譜測定.

1.5 原始數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理參照文獻(xiàn)[18-20]進(jìn)行.

2 結(jié)果與討論

2.1 提取物M-9的LC-UV-MS譜分析

圖1 a.提取物M-9的 UV 190～400 nm檢測 HPLC譜;b.由提取物M-9中相關(guān)成分的[M-H]-離子獲得的提取離子色譜圖

圖1a為提取物M-9的UV 190～400 nm檢測 HPLC譜.從圖中可以看出,該混合物所含組分較為復(fù)雜,各成分之間的相對含量差異較大,并且含有一些微量成分.考察這些組分的紫外吸收光譜發(fā)現(xiàn),其最大紫外吸收峰位于200～220 nm之間,表現(xiàn)出苯環(huán)的結(jié)構(gòu)特征.系列流份的LCMS譜分析結(jié)果表明,提取物M-9中主要有12個(gè)成分,按照這些成分在凝膠色譜柱上洗脫的順序,將各成分編號為C1—C12.從提取物M-9的總離子流色譜圖中提取各成分的[M-H]-離子,得到提取物M-9的提取離子色譜圖(見圖1b),從圖中可以清楚地看到一組[M-H]-離子為m/z315的同分異構(gòu)體.此外,由于各成分間的極性比較接近,即使在優(yōu)化的 HPLC譜分離條件下,色譜峰的重疊仍然比較嚴(yán)重,這表明在常規(guī)分離條件下難以制備得到單體的化合物,因此,本研究采用NMR/LC-MS PDS方法力求解決這類復(fù)雜體系組分群的同步結(jié)構(gòu)鑒定.

2.2 各成分在系列混合物流份中的分布情況

分別取上述12個(gè)成分在系列流份中的紫外吸收峰強(qiáng)度值,然后通過繪制折線圖得到各成分在系列流份中的分布曲線,如圖2所示(因成分C6的含量很高,為了清楚地顯示其他成分的分布情況,該圖中不包括成分C6的變化趨勢).從圖中可以看出,通過凝膠色譜柱的分離,這些成分被洗脫到不同的流份中,同時(shí)每個(gè)成分的含量在系列流份中呈動態(tài)變化,且成分間互相重疊,它們按不同的組成和含量比例構(gòu)成了一系列不完全分離的混合物樣品.這表明,凝膠色譜柱具有和閃式快速分離系統(tǒng)[18]、制備型液相色譜[19]相似的功能,它同樣可以將復(fù)雜的粗提物制成組分含量呈動態(tài)變化的系列混合物流份.此外,凝膠色譜柱還具有上樣量少、樣品不易被吸附等優(yōu)點(diǎn),適合于分離制備少量的樣品及結(jié)構(gòu)中含酚羥基的組分.

圖2 提取物M-9中12個(gè)成分在系列流份中的強(qiáng)度(UV檢測峰面積)分布曲線

2.3 NMR/LC-MS PDS譜的構(gòu)成

對提取物M-9的18個(gè)(15,17-31,33和35號)系列混合物流份分別進(jìn)行 LC-MS和1H-NMR譜測定,然后采用 NMR/LC-MS PDS方法的數(shù)據(jù)處理程序,將系列混合物樣品中[M-H]-離子的選擇離子色譜圖(XIC)與1H-NMR譜構(gòu)成 NMR/LC-MS PDS平行動態(tài)譜,如圖 3所示.在 NMR/LC-MS PDS譜中,橫軸為化學(xué)信息軸,包括選擇離子色譜圖(XIC)的保留時(shí)間和1H-NMR譜的化學(xué)位移值(δ);縱軸為樣品軸(共18個(gè)樣品),組分的譜學(xué)信號沿著這個(gè)軸呈現(xiàn)出動態(tài)的強(qiáng)度變化趨勢.此外,不同質(zhì)荷比(m/z)的XIC圖用不同顏色的譜線顯示,有助于快速識別混合物中存在的同分異構(gòu)體及區(qū)分共流出的組分.例如,m/z315離子分別有3個(gè)信號峰出現(xiàn)在保留時(shí)間6.65,7.48和8.05 m in處,這清楚地表明在混合物樣品中含有3個(gè)相對分子質(zhì)量為316 Da的同分異構(gòu)體.

圖3 提取物 M-9經(jīng)凝膠色譜獲取其系列流份的NMR/LC-MSPDS譜

2.4 提取物M-9中各成分的綜合結(jié)構(gòu)解析

成分信號強(qiáng)度的動態(tài)變化與含量變化呈正比,即來自于同一成分的譜學(xué)信號會在系列混合物樣品中隨同變化,表現(xiàn)為具有相同的成分分布范圍和強(qiáng)度變化趨勢[18-21].根據(jù)這一原理,混合物中屬于同一成分的MS與1H-NMR譜信號就會被相關(guān)及歸屬.本文以C1的結(jié)構(gòu)解析為例,說明應(yīng)用NMR/LC-MS PDS方法開展混合物中組分群的同步結(jié)構(gòu)鑒定過程.

從NMR/LC-MS PDS譜(圖 3)左側(cè)的LCMS信息中可以看出,保留時(shí)間為5.69 min,m/z433.2[M-H]-離子的成分C1分布在15～19號流份范圍內(nèi);在右側(cè)與之對應(yīng)的1H-NMR譜中,也可以看到幾組具有相似強(qiáng)度變化趨勢的化學(xué)位移值,見圖4.其中包括δ4.25和δ4.68處雙峰,芳香區(qū)δ6.5～6.7范圍內(nèi)的一組芳香族質(zhì)子信號.

圖4 提取物M-9系列流份的 NMR/LC-MS PDS譜部分放大圖

高場區(qū)顯示C1兩個(gè)糖的端基質(zhì)子信號為δ 4.68(1H,d,J=7.2 Hz)和δ4.25(1H,d,J=7.8 Hz,),結(jié)合它們的偶合常數(shù)可推斷其為葡萄糖和木糖;在低場區(qū)可觀察到與C1相關(guān)的一組芳香環(huán)上的ABX系統(tǒng)質(zhì)子信號,包括δ6.70(d,J=1.8 Hz,H-2),δ6.65(d,J=7.8 Hz,H-5)和δ6.55(d,J=7.8,1.8 Hz,H-6).另外,在高場區(qū)可觀察到一個(gè)與芳香環(huán)相連的甲氧基質(zhì)子信號δ3.77(3H,s).根據(jù)以上分析及歸屬,可推斷出該結(jié)構(gòu)中存在葡萄糖、木糖和苷元2-methoxybenzene-1’4-diol.圖 5為成分 C1的[M-H]-離子(m/z433)的MS2譜.由圖5可知,m/z433離子主要丟失了140Da而產(chǎn)生m/z293離子,同時(shí)還觀察到了m/z233,m/z215及m/z191等子離子,這表明[M-H]-離子并不發(fā)生常規(guī)的丟失糖基裂解,而是生成糖鏈交叉環(huán)切除反應(yīng)的產(chǎn)物離子.綜合上述歸屬的1H-NMR和[MH]-離子的裂解行為,可以確認(rèn)C1為氫醌苷類化合物,且為氫醌O-雙糖苷類化合物.因此,在相同的 HPLC-MS/MS譜條件下分析4-hydroxy-3-methoxyphenyl-β-D-xylopyranosyl(1 →6)-O-β-D-glucopyranoside,發(fā)現(xiàn)其保留時(shí)間與成分C1相同,且MS2譜中各離子的相對強(qiáng)度及峰型基本一致.

圖5 成分C1的[M-H]-離子(m/z 433)的MS2譜

其他成分的信息挖掘及結(jié)構(gòu)解析如下:如圖3所示,在NMR/LC-MS PDS譜中可以觀察到,成分C2的分布范圍為17～20號流份,與成分C3的分布范圍(17～22號流份)相似,并發(fā)現(xiàn)δ2.72附近有一組多重峰專屬于成分C3,而δ4.92處的糖端基質(zhì)子信號專屬于成分C2.成分C4,C5和C6有著相同的色譜峰顏色以及質(zhì)荷比(m/z315),表明這3個(gè)成分是一組同分異構(gòu)體,其相對分子質(zhì)量為316 Da,其中成分C4和C5的保留時(shí)間分別為6.95 min和8.04 min.成分C6可以清晰地觀察到一組保留時(shí)間為7.48 min的色譜峰,且分布在22～29號流份范圍內(nèi);在右側(cè)與之對應(yīng)的1H-NMR譜中,也可以觀察到幾組具有相似變化趨勢的化學(xué)位移值,其中包括δ4.23處的雙峰,δ2.73,3.65和3.96處的多重峰,以及芳香區(qū)δ6.5～6.7范圍內(nèi)的一組芳香質(zhì)子信號.成分C7和C8有著相同的色譜峰顏色及質(zhì)荷比(m/z331),它們是一組同分異構(gòu)體,其分子量為332 Da,二者的保留時(shí)間分別為 6.65 min和5.54 min.在NMR/LC-MS PDS譜右側(cè)的1H-NMR譜中(見圖3),也可以觀察到幾組與成分C7和C8具有相似強(qiáng)度變化趨勢的化學(xué)位移值,其中包括屬于成分C7的δ6.48和3.75處的單峰,δ4.69處的雙峰;屬于成分C8的δ6.07和3.72處的單峰,δ4.61處的雙峰.成分 C9的保留時(shí)間為11.70min,且[M-H]-離子為m/z299.2;在NMR/LC-MS PDS譜右側(cè)的1H-NMR譜中可以確定δ4.46處的糖端基氫質(zhì)子信號、芳香區(qū)δ7.01和6.63處雙峰的芳香質(zhì)子信號等一組譜學(xué)信號與其相關(guān).成分C10相關(guān)的信號可以確定為:保留時(shí)間在2.96 min處的[M-H]-離子為m/z329.2,δ3.84處的單峰、δ4.96處的糖端基氫質(zhì)子信號和芳香區(qū)δ7.1～7.6范圍內(nèi)的芳香質(zhì)子信號.保留時(shí)間在8.06 min的[M-H]-離子m/z313.2,與之對應(yīng)的δ3.88,3.60,4.47處的雙二重峰,δ4.37處的糖端基氫質(zhì)子信號和芳香區(qū)δ6.5～6.8范圍內(nèi)的芳香質(zhì)子信號等一組譜學(xué)信號來自于成分C11.C12的[M-H]-離子為m/z313,其保留時(shí)間為6.56 min,由于該成分的含量很低,通過觀察放大的NMR/LC-MS PDS譜,發(fā)現(xiàn)在相應(yīng)流份的1H-NMR譜中可找到幾組與上述[M-H]-離子強(qiáng)度具有相似變化趨勢的化學(xué)位移值,其中包括δ4.39處的雙峰,芳香區(qū)δ6.5～7.0范圍內(nèi)的一組芳香質(zhì)子信號,δ4.64,4.43處的雙峰及δ4.09處的雙二重峰等相關(guān)性信息.

通過上述 NMR/LC-MS PDS譜分析,同時(shí)實(shí)現(xiàn)了混合物譜中12個(gè)成分的保留時(shí)間、分子離子、取代糖端基氫的化學(xué)位移及耦合裂分、苷元部分關(guān)鍵氫的化學(xué)位移及峰型等關(guān)鍵結(jié)構(gòu)信息的相關(guān)和歸屬.在上述已歸屬的信息引導(dǎo)下,進(jìn)一步結(jié)合 LC-MS/MS、1H-1H COSY、2D NOESY 譜以及組分間1H峰的積分比例,實(shí)現(xiàn)了混合物中12個(gè)成分無需完全分離的同步結(jié)構(gòu)鑒定.上述12個(gè)成分中,包括3個(gè)氫醌苷類化合物,8個(gè)苯乙醇苷類化合物和1個(gè)香草酸苷類化合物,其中成分C5,C10,C11和C12為首次從本屬植物中發(fā)現(xiàn),各成分的LC-MS和1H-NMR譜數(shù)據(jù)及結(jié)構(gòu)見表1.

表1 小臘樹提取物M-9中12個(gè)成分的LC-MS和1 H-NMR譜數(shù)據(jù)及其結(jié)構(gòu)式

___續(xù)表1

3 結(jié)論

根據(jù)混合物中組分的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),選擇合適的凝膠色譜柱作為分離手段,可以制備組分交叉、含量呈連續(xù)動態(tài)變化的系列混合物流份,而且凝膠色譜柱具有上樣量少,樣品不易被吸附等優(yōu)點(diǎn),適合于分離制備少量樣品及結(jié)構(gòu)中含酚羥基的組分.在利用NMR/LC-MS PDS譜解析成分的結(jié)構(gòu)時(shí),對于樣品分布范圍及其含量變化趨勢接近的成分,可根據(jù)其成分相對應(yīng)的流份范圍,結(jié)合各成分的紫外吸收及提取離子流的強(qiáng)度差異,以及1H-NMR譜信號積分比例的差異,可以將1H-NMR譜信號進(jìn)行歸屬,從而實(shí)現(xiàn)這類性質(zhì)相近成分的結(jié)構(gòu)鑒定.

本文運(yùn)用NMR/LC-MS PDS新型譜學(xué)分析方法 ,并結(jié)合 LC-MS/MS、1H-1H COSY、1D 及2D NOESY譜等進(jìn)行綜合分析,實(shí)現(xiàn)了對小蠟樹提取物M-9中12個(gè)成分的同步結(jié)構(gòu)鑒定,其中4個(gè)成分為首次從本屬植物中發(fā)現(xiàn).實(shí)驗(yàn)表明,本分析方法可以簡化復(fù)雜混合物的分離分析過程,實(shí)現(xiàn)了多組分無需完全分離的快速結(jié)構(gòu)鑒定.

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Simultaneous Structural Identification of Constituents in Extract of Fraxinus Sieboldiana Using NMR/LC-MS Parallel Dynam ic Spectroscopy

HE Jiu-ming, L IU Ying, L IU Ming-tao, ZHANG Rui-ping, SH IJian-gong, Abliz Zeper＊
(StateKeyLaboratoryofBioactiveSubstancesandFunctionsofNaturalMedicines,InstituteofMateriaMedica,
ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China)

Based on the incomp lete separation analysis strategy,the extract ofFraxinussieboldianawas separated into seriesof fractions with the concentration dynamic variation of constituents by gel chromatography.The LC-MS and1H-NMR data of series of fractions were acquired and then p rocessed by Matlab to form NMR/LC-MS PDS.The co rrelation relationship between ions(m/z)and chemical shift(δ)deriving from the same molecule can be extracted simultaneously from themixture spectra.Combined with HPLC-MSn,1H-1H COSY,1D o r 2D NOESY spectra,twelve constituents including three hydroquinone glycosides,eight phenylethanoid glycosides and one vanillic glycoside were identified successfully,in which four compoundswere found from genusFraxinusfo r the first time.

NMR/LC-MS parallel dynamic spectroscopy;incomp lete separation strategy;sim ultaneous structural identification in mixture;Forsythiasuspensa;phenylethanoid glycosides

N55

A

1004-4353(2011)02-095-08

2011-05-04

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助(20775091)

＊通信作者:再帕爾·阿不力孜(1961—),男,博士,研究員,研究方向?yàn)橘|(zhì)譜分析.